[发明专利]万寿菊细胞培养生产游离叶黄素的方法

说明书

万寿菊细胞培养生产游离叶黄素的方法，涉及植物细胞培养技术。按照下述步骤进行：(1)外植体诱导产生愈伤组织细胞；(2)经筛选建立万寿菊愈伤组织细胞系；(3)高产游离叶黄素的悬浮细胞培养系的建立；(4)悬浮细胞扩大培养用于游离叶黄素的生产；(5)细胞中游离叶黄素的提取和产率测定。本发明为一种生产叶黄素的新方法，能够连续生产，不受季节和外界环境的限制，可为临床药用提供新的来源；所获得的细胞产物直接为游离叶黄素，而非叶黄素酯，省去下游皂化反应步骤；细胞产物成分简单，杂质少，易于下游叶黄素的分离、纯化。

技术领域

本发明涉及植物细胞培养技术，具体的说是利用万寿菊(Tagetes erecta L.)细胞培养生产游离叶黄素的方法。

背景技术

叶黄素(IUPAC名：β,ε-carotene-3,3'-diol)是一种含氧的类胡萝卜素，英文名为lutein，CAS注册号：127-40-2，分子式为C₄₀H₅₆O₂。

叶黄素是构成人眼睛视网膜黄斑区域的主要色素，能够滤过蓝光和清除自由基，主要生理功能表现为防止光损伤和抗氧化。叶黄素具有预防和治疗某些眼科疾病的作用，尤其在预防年龄相关性黄斑变性和老年性白内障方面的作用明显。补充叶黄素可提高视网膜黄斑色素密度，防止视力退化和眼部生理结构及功能改变。叶黄素可作为预防和治疗眼科疾病的辅助药物应用于临床。但是，人体自身不能够合成叶黄素，只能从食物中摄取。

2010年，叶黄素的全球市场约为2.33亿美元，而且，预计还会以每年3.6％的增速在增长，到2018年达到3.08亿美元(BBC，2011)。

叶黄素分子内存在3个不对称中心，两个六元碳环由一个含有十八个碳原子的共轭长链相连接。由于叶黄素结构复杂，采用化学方法难以合成单一异构体的叶黄素。目前，商业化生产的叶黄素主要是从万寿菊花中提取。然而，大规模栽培万寿菊，存在占地面积大、生产效率低等问题，而且受到季节、气候以及地域等条件的限制。基于此，迫切需要发展新的技术来解决叶黄素的来源。

利用植物细胞培养技术生产具有生物活性的天然化合物，优势主要表现在目标化合物的生产是在限定的可控条件下完成的，独立于气候变化和土壤条件，可以更好的控制产品的质量和产量。商业化生产用于制药工业的天然化合物需满足以下三个方面的要求：第一，生产成本低；第二，生产体系可靠、可持续生产；第三，生产过程环境安全。与直接从原植物中提取以及化学合成相比较，利用植物细胞培养技术生产天然化合物能够更好地满足以上三点要求，是未来的发展方向。

发明内容

本发明的目的是提供一种生产叶黄素的新方法，具体地说是万寿菊细胞培养生产游离叶黄素的方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

1.将来自万寿菊植株的外植体清洗干净、灭菌，接种于愈伤组织诱导培养基上，诱导产生愈伤组织细胞。

外植体为新鲜万寿菊花的花瓣。

愈伤组织诱导培养基为MS(Murashige and Skoog，1962)基础培养基，添加终浓度0.1～5mg/L 1-萘乙酸(1-Naphthaleneacetic acid)，0.1～5mg/L 6-苄氨基嘌呤(6-Benzylaminopurine)，10～50g/L蔗糖和5～15g琼脂；培养基pH值为5.4～6.2；愈伤组织诱导条件为，黑暗条件下诱导，温度为15～30℃。

2.愈伤组织细胞在同样组成的培养基中连续传代增值培养，经筛选建立细胞形态均一、生长稳定的万寿菊愈伤组织细胞系；

连续传代增值培养具体是指，接种密度为50～200g/L；暗培养；温度为15～30℃；每2～4周继代培养一次。