[发明专利]一种生物分子荧光标记方法及得到的荧光标记的生物分子及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物材料荧光标记技术领域，涉及一种生物分子荧光标记方法及得到的荧光标记的生物分子及其应用。

背景技术

生命科学研究中使用的一些基于荧光的系统中经常使用荧光蛋白(例如，藻红蛋白)或生物发光报告系统。然而，这些技术非常耗时而且无法检测多个目标，同时与合成的荧光染料相比其灵敏度及光稳定性都不够好。使用荧光染料标记的特异性探针的荧光技术能够在基于细胞的应用中检测多个目标，并且与多种荧光设备兼容。

荧光标记是将荧光基团共价连接到蛋白、核酸等分子上的过程。通常使用能够选择性地与目标分子上存在的功能基团反应的荧光素基团衍生物来完成这样的过程。标记化合物标记抗体、蛋白、多肽、配体、合成寡核苷酸和其它生物分子，用于免疫组化、荧光原位杂交(FISH)、细胞示踪、受体标记和细胞化学应用以及生物结构、功能和相互作用探针。将生物分子进行荧光标记，研究人员即可用精确、灵敏的方法，如成像、流式细胞术、蛋白免疫印迹等检测复杂生物复合物的特异组分。在生物技术研究领域中，利用荧光进行标记分析的发展特点是趋于更简便、更灵敏、更稳定、更安全以及更好的选择性等。

通常的反应活性基团包括与氨基反应的异硫氰酸酯衍生物，如FITC和TRITC(荧光素和罗丹明的衍生物)；和氨基反应的琥珀酰亚胺酯，如NHS-荧光素或NHS-罗丹明；以及和巯基反应的马来酰亚胺活化的荧光素，如荧光素-5-马来酰亚胺。这些荧光染料都需要修饰上特定的反应活性基团，增大了荧光染料的合成和分离难度。而且这些荧光染料的水溶性较差，标记抗体、蛋白、多肽和其它生物分子时需要引入有机溶剂，从而会影响生物分子的活性。

因此，在本领域中，迫切需要一些水溶性良好，合成简单、易分离的荧光染料，并且能够在温和的条件下高效标记生物分子的标记方法。

发明内容

针对现有技术，本发明的目的在于提供一种生物分子荧光标记方法及得到的荧光标记的生物分子及其应用。本发明的方法能够在温和的条件下高效地标记生物分子，标记效率高，操作简单。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

一方面，本发明提供一种生物分子荧光标记方法，所述方法为：将荧光分子与含巯基的生物分子溶解在缓冲溶液中，搅拌，透析分离得到荧光标记的生物分子；所述荧光分子为具有如下结构的菁染料化合物中的任意一种或至少两种的组合：

其中，R₁为中的任意一种，m为1-11的整数；R₂为F、Cl、Br或I中的任意一种；n为0、1或2。

本发明利用如上所述特定结构的菁染料化合物作为荧光分子，经过如图1所示的生物分子荧光标记过程可以简单、高效地将含巯基的生物分子进行荧光标记，此荧光标记方法反应条件温和，标记效率高，操作简单。

此类菁染料化合物易于合成、分离和纯化，产率高，并且有很好的水溶性和光学稳定性。它们属于近红外荧光分子，光谱分布在680-900nm的近红外区，能够消除生物体的自发荧光是生物体荧光成像的最佳选择。

优选地，在本发明所述生物分子荧光标记方法中，所述含巯基的生物分子为氨基酸、单糖、核苷酸、抗体、蛋白、多肽、配体或合成寡核苷酸中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述缓冲溶液为pH≥7.4的缓冲溶液，优选pH≥7.4的Tris-HCl、PBS和HEPES缓冲溶液中的任意一种。

优选地，所述荧光分子与所述生物分子的摩尔比(1-4):1，例如1.0:1、1.1:1、1.4:1、1.6:1、1.8:1、2.0:1、2.2:1、2.5:1、2.8:1、3:1、3.2:1、3.4:1、3.6:1、3.8:1或4:1。

优选地，所述生物分子荧光标记的过程在避光条件下进行。

优选地，所述搅拌在20-30℃下进行，例如20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃或30℃。

优选地，所述搅拌的时间为0.5-6小时，例如0.5小时、0.8小时、1小时、1.3小时、1.5小时、1.8小时、2小时、2.3小时、2.5小时、2.8小时、3小时、3.5小时、3.8小时、4小时、4.5小时、4.8小时、5小时、5.5小时、5.8小时或6小时。