[发明专利]一种启动子文库的构建方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种启动子文库的构建方法及其应用。

背景技术

细胞代谢网络的优化和精细研究正在成为生物化工领域一个非常重要的前沿研 究方向。但是，微生物细胞是一个复杂的动态网络，内由基因、蛋白、代谢物、各种信号分子 及它们之间相互作用组成，代谢过程的分析和调控非常复杂和困难。为了能够从中解析出 关键的节点进行精细调控，必须通过精细调控来研究各条路径的作用，从而实现对细胞表 型和代谢流的人为改造。因此，精确的“开量”式基因微调是开展代谢工程研究非常重要的 先进手段，对其开展研究具有重要的科学意义广泛的应用空间。启动子(Promoter)是基因 表达调控最常用的元件，但目前的启动子都无法在一个较宽的范围内对基因表达强度进行 连续的调控。例如诱导型启动子，因为要加入诱导物来达到“开关”的开和关，必然使得研究 的费用增加，而且这种开关灵敏度很低，无法通过对诱导物的量控制来精确控制“开关”的 开合程度。而组成型启动子，因其本身的一些特征，如启动强弱较低，不受外界环境影响等 因素，不能达到目前研究理想的条件。

启动子文库就是对调控基因转录的启动子碱基序列进行突变，通过报告基因 (ReporterGene，如绿色荧光蛋白gfp基因、半乳糖苷酶基因lacZ等)的表达水平，筛选得到 的一系列不同强度的人工启动子集合体。由于启动子的碱基序列直接影响其调控基因转录 的强度，故只要所构建的文库包含足够丰富的突变序列，筛选量足够大，就可以从中筛选出 一系列具有不同调控强度的突变启动子，构成能对其下游基因实施“开量”式微调的文库。 此种方法，能够筛选出一系列强度跨度较大的启动子序列，同时启动子强度易于表征，对代 谢网络中实现精细控制非常理想。

因启动子文库独特的优势，出现后即被应用于代谢工程的研究。Solem等人利用启 动子文库，在乳酸乳球菌(Lactococculslatis)中，不仅对糖酵解途径pfk基因，还对位于 同一操纵子内的另外两个基因(pyk和Idh)实现了强度递增的表达调控。其次，Alper等在研 究蕃茄红素的合成时，发现在野生菌中提高dxs基因(deoxy-xylulose-psynthase，脱氧- 磷酸木酮糖合成酶)的表达，只能在一定程度上提高蕃茄红素的产量，而在过表达该合成途 径下游两个酶的重组菌中，不断增强dxs基因表达能使蕃茄红素产量不断提高，说明脱氧- 磷酸木酮糖合成酶活是重组菌合成途径的限制性因素。同时，Nevoigt等在分析3-磷酸甘油 脱氢酶(GPDH)基因GPD1对酿酒酵母甘油产率的影响时发现，通过突变启动子控制GPDH的酶 比活变化不超过其野生型的2倍时，菌体的生物量和甘油产率均与GPDH活性正相关，但多拷 贝基因的过表达，非但不能使甘油产率相应增加，还对细胞生长产生抑制，因此在代谢改造 中可通过突变启动子文库来精确微调基因表达水平以达到最优化控制。最后，可见，通过构 建启动子文库，将“开量”式微调基因表达成为可能，在代谢分析和改造中，突破了原来只能 通过基因敲除(Knockout)和过表达(Overexpression)两种非“开”即“关”的手段来实现 对细胞基因型的扰动(Perturbation)。

目前，相关文献报道启动子文库的构建方法有如下方法：借助易错PCR方法，对原 始的启动子进行随机突变，获得大量的突变体，然后采用高通量的筛选方法，获得不同强度 的启动子。此种方法因为用了随机突变的方法，导致其突变库极大，无义突变也较高，大大 加大了后期的筛选工作，本发明通过人工合成启动子序列，利用分子生物学手段，实现快 速、高效、高效的构建方法。

发明内容

本发明提供一种启动子文库的构建方法及其应用，采用人工设计的具有启动子特 征的寡核苷酸序列，通过分子聚合和延伸等技术，获得启动子强度跨度理想的启动子文库。

本发明采用的技术手段为：

一种启动子文库的构建方法，包括如下步骤：

1)、根据原核生物启动子的保守区：-10区、-35区，半保守区，随机序列，转录起始 位点和方便连接构建，设计出具有启动子特征的寡核苷酸序列；

2)、将步骤1)设计得到的寡核苷酸序列经退火、延伸形成双链，再连接到带有报告 基因的载体上，得到启动子的突变库；

3)、将步骤2)得到的启动子的突变库转入到宿主细胞中，涂布到相应抗性的平板 中，得到启动子文库。