[发明专利]一种稀土荧光标记的复合微球标记物及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及功能高分子生物材料技术领域，特别是涉及一种稀土荧光标记的 复合微球标记物及其制备方法。作为性能优异的荧光材料，稀土荧光微球标记物 可以广泛应用于医学领域。

背景技术

现有技术中，稀土离子或稀土配合物和二氧化硅掺杂的发光材料已有不少报 道，如Cannasa(Cannasa.C,etal,Mat.Res.Soc.Symp.Proc.676(Y3)18.1-18.6, 2001)描述了一直用溶胶-凝胶法制备直接掺杂铕(Eu³⁺)的Y2O3-SiO2纳米发 光材料；Moran等(C.E.Moranetal,Langmuir2001,17,8376-8379)合成了一直 掺入Pr3+和Er3+的硅纳米颗粒；程艳玲等(程艳玲等,应用化学2008,25(10), 1217-1220)以聚乙烯吡咯烷酮作稳定剂，将单体苯乙烯通过超声辐照分散聚合 制得直径在80nm左右的聚苯乙烯纳米微球。

现有的稀土荧光络合物标记物中，常用的荧光标记物如异硫氰酸荧光素 (FITC)、罗丹明-6-G(R-6-G)等，其荧光寿命普遍都比较短，长期的使用难以克服 背景荧光的干扰，在其检测中通常灵敏度都较低；其中的稀土离子主要是Eu³⁺、 Sm³⁺、Dy³⁺和Tb³⁺同一些有机配合物如β-二酮化合物、邻菲咯啉类化合物、水 杨酸类化合物、联吡啶类化合物等所形成络合物，虽然目前已得到不同程度的应 用，但是都难以同时满足一下要求：(1)、具有强烈的荧光；(2)、稳定性好：包 括热力学稳定和耐光漂白等；(3)、易于与抗体、核酸等生物大分子交联，交联 后能同时保持标记物的高荧光强度和被标记物的生物活性；(4)易合成。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术存在的不足，提供一种具有荧光寿命长、稳定 性好、易合成、成本较低和易标记的一种稀土荧光标记的复合微球标记物及其制 备方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：先将聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、 过硫酸钾(KPS)、苯乙烯(St)加入乙醇或水介质中溶解后置于超声波反应器中， 在氮气的保护下聚合反应；在一定温度下、且保持恒定的功率和氮气气流速，反 应一定时间后得到聚苯乙烯纳米微球分散液；再利用带有活性基团的有机硅烷在 二氧化硅微球引入活性基团，再将稀土荧光络合物4,4,-双(1,1,1,2,2,3,3,-七氟-4, 6,-己二酮基)氯磺基-邻-三联苯-铕(BHHCT-Eu³⁺)或4,7-二氯磺基苯-1,10菲咯啉 -2,9二羧酸-铕(BCPDA-Eu³⁺)通过化学键合的形式固定于二氧化硅微球的表面，

而后在微球表面以带有活性基团的有机硅烷再次引入活性基团，制成稀土荧 光标记的复合微球标记物。

其制备方法包括以下步骤：

(1)、原材料预备：

按重量预备原材料：15-30g聚乙烯吡咯烷酮、0.03-0.10g过硫酸钾、8-12g 苯乙烯、80-120ml乙醇或水和4,4,-双(1,1,1,2,2,3,3-七氟-4,6-己二酮 基)氯磺基-邻-三联苯；

(2)、制备复合微球：

1)、制备氨基化纳米微球：

将15-30g聚乙烯吡咯烷酮、0.03-0.10g过硫酸钾、8-12g苯乙烯加入到 80-120ml乙醇或水介质中溶解后置于超声波反应器中，通氮气排除体系中的氧 气，开启超声波发生器进行聚合反应，在反应6-10小时后得到聚苯乙烯纳米微 球分散液；

离心搜集聚苯乙烯纳米微球，以5mL无水乙醇悬浮，加入5μL氨基硅烷， 室温搅拌反应1小时，以等体积无水乙醇洗涤后收集；

2)、制备稀土荧光纳米微球：

将4,4,-双(1,1,1,2,2,3,3-七氟-4,6-己二酮基)氯磺基-邻-三联苯 配制成1mg/mL，按等体积加入到氨基化纳米微球悬浮液中，室温避搅拌15min， 离心收集，悬浮于50mmol/L、pH值＝7.8的磷酸盐缓冲液中，加入等体积0.1mol/L 氯化铕溶液，室温避光搅拌反应10min，

离心收集后悬浮于等体积无水乙醇溶液中，加入5μL氨基硅烷，室温搅拌 反应1小时，以等体积无水乙醇洗涤后收集，即得到稳定的稀土荧光标记的复合 微球标记物。