[发明专利]酶引发的自由基聚合反应及检测应用

说明书

本发明提供一种新型的信号放大体系和方法，可以用于化学生物医学检测。本发明利用过氧化物酶和G四链体过氧化物酶构建自由基引发体系，用于引发自由基聚合，并利用聚集诱导发光实现荧光信号放大。本体系可以实现对核酸的检测和适配体靶标的检测。本方法可以在荧光定量PCR仪上使用，通过荧光信号获得检测物浓度。相对于PCR、滚环扩增等核酸扩增的方法，本方法不涉及核酸扩增的过程，因而不需要DNA聚合酶等价格昂贵的试剂，也不存在核酸的非特异性扩增的问题。本方法还可以与酶联免疫法、ELISA和核酸扩增等方法联用，实现多轮信号放大，并用于抗体抗原的检测。

技术领域

本发明利用酶引发自由基聚合反应来实现检测信号的放大，属于生物检测、荧光检测领域。

背景技术

荧光传感因为灵敏度高、样品用量少，在化学、生物检测及临床医学诊断方面应用非常广泛。荧光传感离不开荧光探针的设计与合成，荧光探针可以与样本中的目标分子结合或发生化学反应，从而使探针分子的荧光发生改变，再通过仪器或肉眼观察即可判断样本中目标分子的含量。

为了提高荧光信号的强度，一般将酶反应或者催化剂引入到检测体系中，使荧光信号放大，从而提高检测的灵敏度。酶联免疫法，包括酶联免疫吸附测定法 (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA) 在分析化学领域中应用广泛，已经成为抗体抗原检测的主要方法之一。在这种测定方法中有3种必要的试剂：固相的抗原或抗体、酶标记的抗原或抗体、酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。其检测原理和过程为：首先使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性；其次使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性；在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应，用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅来进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，故有信号放大的效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。

核酸扩增是核酸聚合酶催化的特殊聚合反应，在检测信号放大中应用广泛。根据核酸扩增反应中温度变化要求，可以将核酸扩增技术分为两大类：一类是聚合酶链式反应（PCR）技术，另一类是核酸恒温扩增技术。无论是PCR技术还是恒温扩增技术，它们信号放大的本质都是扩增特定序列的DNA片段，能将微量的DNA数量级倍扩增，从而大大提高检测灵敏度。一个PCR反应需要以下几种物质的参与：模板序列，引物序列，DNA聚合酶，核苷酸单体。模板序列为需要被放大的DNA序列，含量很少，其他三种物质都是足量的。在一轮扩增反应中，引物与模板结合后在聚合酶催化下，与核苷酸单体发生聚合反应，形成新的DNA链可以做为下一轮扩增反应的模板，因而每一轮扩增之后，模板数量翻倍，十几轮扩增后模板DNA数量增加了几千上万倍，结合双链DNA染料后荧光显著增加。核酸等温扩增技术是在PCR技术基础上发展的核酸扩增技术，如链替代等温扩增、滚环扩增及环介导等温扩增等，这些扩增技术同样用到模版序列和DNA聚合酶，及核苷酸单体等，恒温扩增技术在实际操作和仪器要求方面比PCR技术更为简单方便，近些年在核酸检测领域也有许多发展和应用（参考文献：Chem. Rev. 2015, 115, 12491−12545；J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 7430-743等）。