[发明专利]一种铜绿假单胞菌重组蛋白Vac33及制备方法和应用

说明书

本发明提供了一种重组蛋白，所述重组蛋白由铜绿假单胞菌III型分泌系统组件蛋白(PcrV)的片段通过连接肽(Linker)与铜绿假单胞菌外膜脂蛋白(OprI)的片段融合而成，所述重组蛋白具有通式：PcrV片段‑(Linker)_n‑OprI片段；其中，所述连接肽(Linker)序列选自GGGGS、GGSGG、YAPVDV中的一个，优选为GGGGS；n为1、2、3或4，优选为1。本发明还提供了上述重组蛋白的制备方法和应用。利用本发明的重组蛋白制备的亚单位疫苗可激发机体产生高滴度IgG抗体，可用于诊断试剂、预防或治疗性药物的制备。

技术领域

本发明属于生物技术制药领域，具体涉及一种铜绿假单胞菌重组蛋白Vac33(PcrV-OprI)，本发明进一步涉及该重组蛋白的制备方法及其应用。

背景技术

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)俗称绿脓杆菌，为非发酵菌中的假单胞菌属，广泛分布于自然界、正常人皮肤、肠道、呼吸道中，在医院病房及医疗器械中也普遍存在，是临床上最为常见的条件致病菌之一。目前在全球范围内，该菌已成为ICU病房、烧伤、战创伤感染，机械通气相关肺炎(VAP)分离率最高的病原菌之一。PA感染可发生在人体任何部位和组织，如烧伤或创伤部位、中耳、角膜、尿道和呼吸道等，也可引起心内膜炎、胃肠炎、肺炎甚至败血症等全身感染，全身感染死亡率超过20％。

此外，由于抗生素的滥用等原因，PA的耐药问题逐渐突出，出现了泛耐药铜绿假单胞菌(PDR-PA)和多重耐药铜绿假单胞菌(MDR-PA)，且耐药性PA的分离率逐年上升。中国CHINET2005--2012年连续监测资料显示，PA对常用抗菌药物的耐药率保持在较高水平，但略呈下降趋势。如亚胺培南的年度耐药率分别为31.0％、42.8％、35.8％、30.5％、30.5％、30.8％、29.1％和29.1％，对美罗培南的年度耐药率分别为32.0％、34.1％、28.5％、24.5％、25.2％、25.8％、25.0％和27.1％，但其中泛耐药(PDR-PA)菌株数量显著增多，在2011年和2012年分别达到1.8％和1.5％(铜绿假单胞菌下呼吸道感染诊治专家共识，中华结核和呼吸杂志，2014年1月37卷1期)。由于PA在临床上的高感染率和耐药率的不断攀升，寻找新的“非抗生素疗法”迫在眉睫，从免疫学角度入手，研制开发出安全有效的疫苗成为最为理想的选择。

基因工程亚单位疫苗通过基因工程的手段，将病原体的致病因子或其突变体的基因克隆至的蛋白表达载体，重组子在工程菌内进行大规模表达，经过纯化后制备成基因工程亚单位疫苗。该疫苗具有工艺简单、成本低、可操作性强等有点，已成为疫苗研发的重要方向。研发基因工程疫苗 的关键是筛选到良好的保护性抗原分子。

铜绿假单胞菌的III型分泌系统是由20多个蛋白质组成的注射器样的大复合物，能够将一些毒力因子(如ExoU、ExoS、ExoY、ExoT等)及其它效应蛋白直接注入宿主细胞，引起宿主细胞损伤从而在细菌感染性疾病中发挥重要作用。PcrV是铜绿假单胞菌III型分泌系统的重要组件之一，它能够形成同源多聚体，组装成分泌系统运输毒力因子和效应蛋白的“管道”，是铜绿假单胞菌III型分泌系统的关键组件(Teiji S.等，Critical Care2014)。鉴于PcrV在铜绿假单胞菌致病中的重要作用，该蛋白已成为铜绿假单胞菌感染治疗性抗体针对的重要靶标。抗PcrV的多克隆抗体、单克隆抗体都能够抑制III型分泌系统的分泌，保护机体受到铜绿假单胞菌的入侵(Sawa，T.等.Nat Med 1999，Milla，C.E.等PediatrPulmonol 2014，Frank，D.W.等J Infect Dis 2002，Baer，M.等Infect Immun 2009。同样PcrV也是重要的候选疫苗分子，但由于其本身能够形成同源多聚体等原因，目前还未见有可溶性重组表达该蛋白单体的报道。