[发明专利]一种基于双色时间分辨荧光标记‑磁分离适配体识别同时检测两种致病菌的方法

说明书

技术领域

一种基于双色时间分辨荧光标记-磁分离适配体识别同时检测两种致病菌的方法，涉及纳米材料和分析化学技术领域，用于对食品中鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌进行同时检测。

背景技术

食源性疾病通常指随着食物摄入人体的生物性、物理性、化学性有毒有害物导致人体感染或中毒的疾病。食源性致病菌就是能引起食物中毒或感染的致病性细菌。鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌是最常见的引起食源性疾病的致病菌。鼠伤寒沙门氏菌是一种需氧或兼性厌氧的革兰氏阴性菌，周身鞭毛，无荚膜，最适生长温度是34℃～37℃，最适pH为7.0～7.8。沙门氏菌生长能力很强，且对环境的抵抗力强，甚至可以在低温、缺氧和干旱条件下存活4个月。它是一种人畜共患致病菌，可污染食品并大量繁殖，其致病机制是随食物经口进入人体后会随淋巴系统进入血液，造成人体感染，不仅如此，鼠伤寒沙门氏菌入侵肠道后菌体裂解后会产生大量内毒素，内毒素作用于肠粘膜引发宿主全身性炎症，出现中毒症状。由鼠伤寒沙门氏菌引起的食物中毒具有发病率高，发病时间短等特点。金黄色葡萄球菌是一种需氧或兼性厌氧革兰氏阳性菌，最适生长温度是30℃～37℃，最适pH为7.0～7.5,是葡萄球菌属中最重要的致病菌之一。由于金黄色葡萄球菌可在有氧或无氧的环境中生长，高度耐盐、并且对温度(6.5℃～46℃)和pH(4.2～9.3)要求很低，因此能广泛的存在于食品当中。金黄色葡萄球菌是一种重要的人畜致病菌，可引起许多严重的感染，其致病机制是侵袭人体后引起化脓性感染，通过分泌肠毒素等外毒素和酶类造成急性肠炎，引起呕吐、腹泻等；或者菌体直接侵入人体，引起化脓性感染、肺炎、肠炎等。根据相关数据统计，金黄色葡萄球菌在全球范围内为仅次于大肠杆菌第二常见的与食品中毒相关的病原体。

目前，食源性致病菌的测定方法主要有平板计数法，聚合酶链式反应(PCR)、环介导等温扩增方法(LAMP)、免疫学方法，如酶联免疫吸附法(ELISA)、免疫荧光技术(IFT)、胶体金免疫层析技术(GICA)、免疫磁珠分离技术(IMB)等。其中ELISA已被高度商业化，成为目前食品安全、环境监测、医疗诊断中常用的检测方法，它结合了酶催化作用的高效性和抗原抗体反应的特异性，达到快速灵敏检测的目的，但ELISA方法检测致病菌仍然需要足够数量的细菌进行反应，因此在检测前需要进行预增菌培养阶段，此工序费力且耗时较长，限制了其进一步应用。ELISA与GICA都是基于抗原抗体亲和反应，一抗体作为识别分子易受外界条件影响，尤其是温度，而且抗体的制备需要经过动物或细胞实验，繁琐费时，成本较高，因此检测成本也偏高。所以开发一种快速方便，稳定性好、灵敏度高、特异性强、成本低廉的新型检测方法很有必要。

核酸适配体(Aptamer)通过SELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，指数富集配体系统进化)技术筛选的与靶物质特异性结合的一簇小分子DNA或RNA片段。SELEX技术是20世纪90年代发展起来的一种新的组合化学技术，具有经济、简便、 快速、适用范围广等特点。核酸适配体能够识别与之对应的任何类型的蛋白和低分子等靶物质，并与靶物质具有高度亲和力。与抗体相较，核算适配体有诸多优点，比如体外合成周期短，制备成本低，无需动物实验；稳定性好，对温度不敏感；易于修饰等等，而且适配体作为识别分子已经在临床诊断、临床治疗、药物运输、蛋白质组研究和食品安全中得到广泛应用。