[发明专利]HLA-A0201限制性抗Her2-neu抗原特异性CTL的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术开发与应用研究领域，涉及HLA-A0201限制性抗Her2-neu抗原 特异性CTL制备方法。

背景技术

一、肿瘤治疗的困境与机会

恶性肿瘤已成为人类第一号“杀手”，手术、放疗与化疗是治疗肿瘤的三大常规方法， 能在短期内有效的减轻肿瘤负荷，但仍不能有效清除肿瘤细胞。微小残留病灶、对放疗、 化疗的部分敏感和耐药是肿瘤复发及转移的根源，而复发与转移正是肿瘤患者死亡的主要 原因。常规治疗方法已力不从心，开发新型的肿瘤治疗技术与产品迫在眉睫。

二、细胞免疫治疗技术的诞生与发展

上世纪80年代起免疫学与肿瘤学的迅速发展，1982年美国NIHRosenberg教授为首 的研究小组研制出淋巴因子活化的杀伤细胞(LAK)免疫疗法，并在后续研究中对LAK 细胞的临床应用进行了深入的探讨。但是LAK细胞杀伤力不够强，临床应用需要大量输 注(3×10^10-11)，另一方面扩增能力有限，需要在输注细胞的同时大剂量应用白细胞介素-2 (IL-2)(10万IU/kg，q8h)，因而产生了相关的不良反应。而后Rosenberg又提出了肿瘤 浸润淋巴细胞(TIL)，其杀瘤能力较LAK有了明显提高，并且无需大剂量IL-2联合应用， 但细胞需要从肿瘤组织中分离获得，这极大限制其广泛的临床应用。在以上的工作基础上， 1991年Stanford大学的Schmidt-Wolf等采用干扰素γ(IFN-γ)、IL-2和鼠抗人CD3单克隆 抗体(Mouseanti-HumanCD3mAb)共同诱导出了具有强大抗肿瘤活性的细胞群，命名为 细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)。

树突状细胞(DCs)是迄今为止已知的体内功能最为强大的专职抗原递呈细胞(APC)， 其表面存在丰富的抗原捕获分子，抗原递呈分子(MHCI类和MHCⅡ类分子)，免疫共刺 激分子(CD80、CD83、CD86、CD40等)。经抗原刺激后的DC细胞向淋巴结迁移，将其 携带的抗原信息传递给相应的T淋巴细胞，启动、激发CD4+/CD8+T细胞免疫应答，特异 性地杀灭肿瘤细胞。同时经抗原刺激后的DCs可分泌白细胞介素-8(IL-8)、干扰素α (IFN-α)、白细胞介素-12(IL-12)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)等，增强机体非特异性免 疫应答(天然免疫)，故DC有“天然免疫佐剂”的美称，其发现者RalphSteinman教授获得 2011年诺贝尔医学奖。鉴于DC在机体免疫防御系统中所处的中心地位，基于DC开发的 抗肿瘤疫苗已使之成为最先进、最有希望的肿瘤免疫治疗技术之一，近年来国内外学者对 其进行了广泛的探索。1992年Stanford医学院的2位教授成立了世界上第一家以DC为基 础的肿瘤疫苗公司(Dendreon，CA)，该公司的产品Provenge已于2010年4月29日获得 FDA批准上市。但是DC在体内的功能受到患者本身免疫状态，肿瘤微环境的影响，而肿 瘤患者体内存在大量抑制因子，因此DC的体内效果并不如体外效果理想。

细胞毒性T淋巴细胞(CTL)构建是近期兴起的免疫治疗技术，因其具有特异、直接 杀伤肿瘤靶细胞的能力，因此成为研究的热点。

三、Her2-neu在肿瘤免疫治疗中的作用

Her2-neu是一种原癌基因，编码产物为185kD的跨膜糖蛋白p185，主要包括胞外区、 跨膜区和胞内区三部分，其中胞外区富含半胱氨酸，含2个配体结合域；跨膜区起锚定作 用；胞内区具有内在酪氨酸激酶活性，且含自身酪氨酸磷酸化位点。Her2-neu原癌基因通 过扩增或转录异常而表达，也可通过基因突变被激活，与多种上皮细胞起源的肿瘤发生关 系密切。在多种恶性肿瘤组织中存在扩增和p185的高表达状态。

1998年美国FDA批准人源化的重组Her2单克隆抗体Herceptin应用于临床，治疗有 Her2-neu基因扩增和过表达的乳腺癌患者；2010年欧盟又批准Herceptin用于Her2阳性胃 癌患者的治疗，同年10月，美国FDA也批准Herceptin用于治疗晚期胃癌。