[发明专利]一种提高基因编辑后绵羊胚胎成纤维细胞同源重组修复频率的方法

说明书

本发明公开了一种提高基因编辑后绵羊胚胎成纤维细胞同源重组修复频率的方法。本发明提供了抑制含有基因编辑DNA片段的离体绵羊胚胎成纤维细胞中Lig4基因表达的物质在制备促进含有基因编辑DNA片段的离体绵羊胚胎成纤维细胞同源重组修复产品中的应用。本发明的实验证明，本发明筛选到抑制绵羊Lig4基因表达的siRNA，通过siRNA抑制绵羊Lig4基因表达,抑制绵羊胚胎成纤维细胞的NHEJ修复途径从而刺激细胞内HR修复途径，提高了细胞采用HR修复的频率，为提高绵羊胚胎成纤维细胞基因打靶效率和研究绵羊基因组精确编辑提供基础。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种提高基因编辑后绵羊胚胎成纤维细胞同源重组修复频率的方法。

背景技术

利用人工核酸内切酶(Engineered endonuclease,EEN)，如锌指酶(Zinc fingernucleases，ZFNs)、类转录激活因子效应物核酸酶(Transcription activator-likeeffector nucleases,TALENs)和CRISPR/Cas9(Clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated 9(Cas9))，定点切割基因组，产生特定位点基因组双链断裂(Double-strand brakes,DSBs)或缺克(Nicks)，促进精确编辑哺乳动物基因组的研究。

细胞主要通过非同源末端连接途径(Non-homologous end joining,NHEJ)修复DSBs，产生基因敲除表型。共同转染EEN和单链寡核苷酸，或同源序列的供体模板，通过依赖同源模板修复途径，如微同源臂介导连接(Microhomology-mediated end joining,MMEJ)和同源重组(Homologous recombination,HR)，精确地将外源目的基因敲入细胞基因组，实现基因编辑。即使采用高效的CRISPR/Cas9系统产生基因组的DSBs，细胞选择NHEJ修复事件的发生概率超过90％，利用同源模板的修复概率低于10％。说明多数细胞中，NHEJ远远超过依赖同源模板修复事件的发生概率。

抑制NHEJ途径，促使细胞采用HR修复途径，能够提高HR修复频率。用EEN定点断裂果蝇细胞基因组，RNA干扰(RNA inhibite,RNAi)瞬时抑制Lig4基因(DNA Ligase 4,Lig4)翻译，PCR扩增短的左右同源臂(80和60nt)供体模板，在药物筛选的细胞中，同源重组效率达50％。EEN处理Lig4-/-突变体的果蝇胚胎、拟南芥，与野生型比较，同源重组效率显著提高。调控抑制线虫(Caenorhabditis elegans)体细胞中的Lig4蛋白因子，从而抑制NHEJ，使有机体修复DSBs途径转向MMEJ。Bmku70蛋白是NHEJ的必须因子，敲除Bmku70基因的家蚕胚胎，显微注射CRISPR/Cas9系统质粒和供体模板，与野生型家蚕胚胎比较，HR效率更高。SCR7(5,6-bis(benzylideneamino)-2-mercapto-pyrimidin-4-ol)特异性同人类Lig4蛋白的DNA结合域(DNA binding domain,DBD)结合，阻断了Lig4与DNA结合，抑制NHEJ修复途径，提高HR修复频率4-5倍。

Lig4敲除的果蝇能够正常生存，但小鼠Lig4基因敲除表现为胚胎致死，至今对哺乳动物Lig4基因敲除的研究较少。哺乳动物细胞修复DSBs的3条主要途径：NHEJ、MMEJ和HR，呈现互补竞争关系，抑制NHEJ将刺激细胞选用HR修复途径。

Gorbunova实验室定量研究NHEJ和HR修复途径，获得细胞老龄化状态不同，对基因组DSBs修复结果不同；人类体细胞修复DSBs，主要采用NHEJ途径，而且在细胞周期各个阶段都可以使用NHEJ；HR修复主要发生在S期。

基因打靶技术以同源重组为基础，是一种定向改变生物活体遗传信息的实验手段，促进了生物学研究。正常哺乳动物细胞发生同源重组概率极低，造成基因打靶效率极低(10^-6)。