[发明专利]一种应用流式细胞仪分析评价小鼠骨髓红细胞生成功能的方法

说明书

技术领域

本发明涉及流式细胞术技术领域，具体涉及一种利用流式细胞仪分析评价小鼠骨髓红细胞生成功能的方法。

背景技术

成熟红细胞是机体血液中数量最多的一种血细胞，是机体通过血液运送氧气的最主要的媒介，近年来研究发现红细胞也是机体重要的免疫活性细胞，在抗疾病、抗肿瘤中亦扮演重要角色。而成熟红细胞是由骨髓红细胞系统中的红系祖细胞经原红细胞、幼红细胞和网织红细胞逐步分化发育而来。因此，检测各时期红细胞数量比例用以分析评价骨髓红细胞生成功能，对于进一步探究红细胞在机体中发挥的作用具有重要的意义。

小鼠作为最为常用的实验动物已广泛应用于食品、化妆品、药品、生物制品、工业产品和医学及生命科学等的安全性、毒性和效力等方面的实验和检验。传统用于评价小鼠骨髓红细胞生成功能的方法主要是骨髓涂片镜检进行人工计数，这种方法费时、工作量大，受人的主观因素影响比较大，观察的数量较少，且一般只能计数200-400个细胞，所以存在一定误差。

目前，用流式细胞仪来分析评价小鼠骨髓红细胞生成功能已经越来越受到人们的关注。由于流式细胞仪检测速度可达每秒2000个细胞，共计数20,000个细胞，极大提高了检测的准确性，并为样本数量较多的实验设计提供了一个快速、准确、可行的实验方法。有报道使用小鼠细胞表面标记物CD71和Ter119进行双参数标记进行小鼠红系细胞的研究，但该方法无法区分网织红细胞和成熟红细胞，且抗体价格普通高昂，同时使用CD71和Ter119两种抗体使得检测成本偏高，不利于推广应用。

发明内容

本发明是为克服现有评价分析小鼠骨髓红细胞生成功能技术中的不足之处，提供一种利用流式细胞仪快速、准确、简单易行且成本较低的分析评价小鼠骨髓红细胞生成功能的方法。

本发明采用的技术方案如下：

一种应用流式细胞仪分析评价小鼠骨髓红细胞生成功能的方法，包括如下步骤：

1.取小鼠骨髓细胞，计数，取一定数量的细胞；

2.向小鼠骨髓细胞加入噻唑橙染色液孵育，洗涤，离心，弃上清；

3.加入大鼠IgG进行孵育；

4.加入APC Rat Anti-Mouse Ter119进行孵育；

5.加入PBS，流式细胞仪检测分析；

6.收集一定数量细胞，采用流式软件分析荧光群体的细胞分布。

优选的，所述步骤1中所取小鼠骨髓细胞数为100万；

优选的，所述步骤2中噻唑橙使用浓度为0.05-1μg/ml，使用量为每百万小鼠骨髓细胞添加0.1-2ml，小鼠骨髓细胞与噻唑橙孵育温度为室温，孵育时间为5-60分钟；

优选的，所述步骤3中大鼠IgG使用浓度为0.1mg/ml，使用量为每百万小鼠骨髓细胞添加0.1-0.2ml，小鼠骨髓细胞与大鼠IgG孵育温度为4℃，孵育时间为10min；

优选的，所述步骤4中APC Rat Anti-Mouse Ter119的使用浓度为1-20μg/ml，使用量为每百万小鼠骨髓细胞添加0.1-0.2ml，小鼠骨髓细胞与APC Rat Anti-Mouse Ter119的孵育温度为4-20℃，孵育时间为10-60min；

优选的，所述步骤5中PBS添加量为每百万小鼠骨髓细胞添加0.1ml；

优选的，所述步骤6中收集细胞数为2万。

本发明作用机理：

Ter119在原红细胞、幼红细胞、网织红细胞和成熟红细胞的细胞膜上均有表达，而在红系祖细胞、白细胞以及造血干细胞等细胞中不表达，采用APC荧光标记的抗Ter119抗体标记小鼠骨髓细胞，可将细胞整体分为Ter119阳性细胞和Ter119阴性细胞。噻唑橙可以与细胞中的RNA和DNA结合并产生荧光，成熟红细胞中无RNA和DNA，网织红细胞中有少量RNA和DNA，而原红细胞和幼红细胞(包括早幼红细胞、中幼红细胞和晚幼红细胞)中有大量RNA和DNA。因此，采用噻唑橙染色可以将Ter119阳性的细胞群体再分成三群，分别是成熟红细胞(Ter119+噻唑橙-)，网织红细胞(Ter119+噻唑橙+)，幼红细胞和原红细胞(Ter119+噻唑橙++)。

本发明的有益效果是：

(1)本发明采用Ter119设门策略，以纯化目的细胞，从而减少了小鼠骨髓中其它细胞群体的影响，降低了背景染色，使结果更可靠。