[发明专利]一种用于非水相环境催化的磷酯酶印迹激活方法

说明书

技术领域

本发明属于生物化工催化剂活化领域，特别涉及一种用于非水相环境催化 的磷酯酶印迹激活方法。

背景技术

磷脂酶(Phospholipase,EC3.1.1.4；EC3.1.1.3；EC3.1.4.4；EC3.1.1.5)是一 大类具有重要价值的水解酶，具有催化磷脂类化合物的合成、水解、转酯、酯 交换等多种反应的能力，是化工生产，医药合成及食品加工中最重要的酶之一。 常见磷脂酶主要包括磷脂酶A1，磷脂酶A2，磷脂酶C，磷脂酶D等几类。例如磷 脂酶A1和磷脂酶A2，能在油水界面上催化磷脂及甘油三酯α位和β位的酯水 解、醇解、酯合成、酯交换等反应，在食品、化工，特别是油脂精炼等多个领 域被广泛应用。磷脂酶C催化甘油与磷酸基团之间磷酸酯键等合成与断裂，主要 用于油脂精炼行业。磷脂酶D催化磷脂中磷酸基团与碱基之间等水解、合成、转 酯等，在医药化工行业中具有重要地位。

对绝大部分常规酶来说，催化反应是在水溶液环境中进行的，有机溶剂能 明显降低酶的催化能力，甚至使酶失活，但不少具有重要价值的产品的合成和 一些重要的反应需要在非水相环境中尤其是有机溶剂中进行，如毛油及混合油 的酶法精炼。因此，提高酶在非水相催化过程中的性能就成为了研究的热点。 非水相酶催化概念由Zaks和Klibanov在1984年提出，他们发现某些脂肪酶在 有机溶剂环境下仍具有一定的催化活力，并以此为基础合成了一系列有机化合 物。经过几十年的发展，非水相酶催化技术得到一定的发展，溶剂系统不再局 限在单一有机溶剂，所使用酶的种类也得到了进一步拓展。相较于非生物催化 化工及水相生物催化，非水相酶催化具有一定优势，主要表现在增加底物有效 浓度；反应平衡向合成方向移动；微生物污染少；酶热稳定性提高；酶重复使 用性提高；下游过程能耗降低；减少副反应；提高酶特异性和选择性等方面。 然而，非水相中酶活性不高始终是制约该技术发展进入工业应用的最大因素。 随着相关研究的不断推进，深入探讨酶在有机相中活力降低的原因，发现这些 原因是可以解决的，通过合理的、系统的策略设计，及酶激活改性，可多数量 级的提高酶在有机相中的活力，并最终达到酶在水相中的活力水平。

磷脂是毛油中的主要杂质之一，以溶质状态均匀分散在毛油或混合油中。 磷脂在高温条件下，容易发生化学反应生成深色色素及异味化合物，更高温度 下脱水焦化，严重影响食用油品质。磷脂含量较高的食用油在后期储藏过程中， 极易氧化酸败，品质劣变。因此，去除毛油中的磷脂是油脂精炼过程中重要的 一环，该过程也叫毛油脱胶。工业上常用的水化脱胶，利用磷脂分子的两亲性 质，往毛油中加入一定量的水，卵磷脂等亲水性较强的磷脂吸水膨胀，聚团形 成胶状沉淀从毛油中分离出来。但非水化磷脂，特别是磷脂酸钙镁盐，不能以 这种形式从毛油中分离。酶法脱胶可以利用磷脂酶的催化活力，将非水化磷脂 转化为亲水性更强的溶血磷脂进而水化分离，或者切除磷酸基团，将其转化为 二酰甘油，以达到脱除磷脂的目的。由于毛油脱胶体系与常规水相反应体系差 异较大，特别是在混合油体系中，正己烷或轻质溶剂油对酶活力有强烈抑制作 用，很多磷脂酶不能像在水溶液中一样表现较高的活力，提高磷酯酶在非水相 条件下的活力意义重大。

发明内容

本发明的目的在于提出一种适用于非水相环境催化的磷酯酶印迹激活方 法。

本发明是通过以下技术方案实现的：一种用于非水相环境催化的磷酯酶印 迹激活方法，包括以下步骤：

(1)磷脂酶印迹激活：将磷脂酶溶解于含印迹因子的缓冲液中进行激活， 印迹因子为磷脂或其衍生物；

(2)印迹磷脂酶固定化：加入硅藻土，充分震荡混匀、静置，完成固定化 吸附；

(3)冻干：将完成固定化及抗冻保护的印迹磷脂酶进行预冻，再进行真空 冷冻干燥呈粉末，即为固定化印迹磷脂酶粉；

(4)洗涤：固定化印迹磷脂酶粉中加入洗涤液，充分涡旋振荡分散，静置 后滤去溶剂，重复洗涤，洗去印迹因子；

(5)脱溶：将洗涤好的酶粉进行真空干燥，除去残留的有机溶剂，得成品 酶粉。

优选地，步骤(1)中缓冲液浓度为10～500mMol/L，激活条件为4～40℃、 2～30min。

优选地，步骤(1)中所述的印迹因子与缓冲液的体积比为1:10～250。