[发明专利]一种利用免疫荧光测定古代羊毛织品的检测方法

权利要求书

1.一种利用免疫荧光测定古代羊毛织品的检测方法，其特征在于采用如下步骤：

A）取三块大小一致的文物样并分别放置于三个打孔皿中，并将打孔皿分别标记为A、B、C；用pH7.4的PBS缓冲液对文物样进行洗涤直至文物样表面无附着物；接着向A中加入10-50体积份的兔抗羊毛角蛋白抗体稀释液，向C中加入10-50体积份的pH7.4的PBS溶液，B不作处理；分别将A、B、C冷藏10-14h；然后分别向各打孔皿中加入1500-2500体积份的pH7.4的PBS溶液，浸泡4-6min，洗涤三次，每次2-4min；

B）分别向A、B中加入10-50体积份的绿色荧光素标记山羊抗兔IgG（H+L）抗体稀释液，向C中加入10-50体积份的pH7.4的PBS溶液；然后分别将A、B、C放置于底层铺有湿毛巾的盒子中，用锡箔纸将盒子密封，36-38℃避光孵育0.5-2h；然后分别向各打孔皿中加入1500-2500体积份的pH7.4的PBS溶液，浸泡4-6min，洗涤三次，每次2-4min；

C）分别向A，B，C中加入8-12体积份的缓冲甘油进行封片；

D）将A，B，C放置于激光共聚焦显微镜下进行观察；若B，C未发出绿色的荧光，而A发出了绿色的荧光，说明文物样与兔抗羊毛角蛋白抗体发生了特异性结合，证明文物样为羊毛织品。

2.如权利要求1所述的一种利用免疫荧光测定古代羊毛织品的检测方法，其特征在于，所述pH7.4的PBS缓冲液配制方法如下：称取KCl0.2g，KH₂PO₄0.27g，NaCl8.0g，Na₂HPO₄1.42g，用800mL蒸馏水溶解并定容至1000mL，调节pH至7.4。

3.如权利要求1所述的一种利用免疫荧光测定古代羊毛织品的检测方法，其特征在于，步骤C）中所述缓冲甘油的配制方法如下：称取Na₂CO₃0.15g，NaHCO₃0.29g，用800mL蒸馏水溶解并定容至1000mL，调节pH至9.6；将pH9.6的PBS缓冲液和丙三醇按照体积比1:1混合。

4.如权利要求1所述的一种利用免疫荧光测定古代羊毛织品的检测方法，其特征在于，所述兔抗羊毛角蛋白抗体稀释液的制备方法为：用质量浓度为1%的牛血清白蛋白溶液将初始浓度为1mg/mL的兔抗羊毛角蛋白抗体稀释10-200倍。

5.如权利要求1所述的一种利用免疫荧光测定古代羊毛织品的检测方法，其特征在于，所述绿色荧光素标记山羊抗兔IgG（H+L）抗体稀释液的制备方法如下：用质量浓度为1%的牛血清白蛋白溶液将绿色荧光素标记山羊抗兔IgG（H+L）抗体溶液稀释50-500倍。

6.如权利要求5所述的一种利用免疫荧光测定古代羊毛织品的检测方法，其特征在于，绿色荧光素山羊抗兔IgG（H+L）抗体溶液的制备方法如下：向每2.5-3.5mLpH为5.5的PBS缓冲液中依次加入0.14-0.16mg的绿色荧光微球、2.6-2.8μL的现配的浓度为4-6mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺溶液和8-12μL的浓度为1mg/mL的山羊抗兔IgG（H+L）抗体溶液，得到混合液，将所述混合液在室温下搅拌1.5-2.5h，用1wt%的牛血清蛋白溶液封闭25-35min后在8000-10000r/min、4℃条件下离心处理8-12min，移除上清液，将沉淀加入到体积为山羊抗兔IgG（H+L）抗体溶液1倍pH为5.5的PBS缓冲液中复溶、混匀，制得绿色荧光素标记山羊抗兔IgG（H+L）抗体溶液。