[发明专利]一种具有强热稳定性的甜味蛋白monellin突变体及其制备方法

权利要求书

1.一种具有强热稳定性的甜味蛋白monellin突变体，其特征在于，将野生型单链 monellin基因第23位氨基酸谷氨酸(Glu)定点突变为丙氨酸(Ala)。

2.根据权利要求1所述的一种具有强热稳定性的甜味蛋白monellin突变体，其特征在 于，与野生型单链monellin蛋白相比，甜味未下降，热稳定性提高20℃。

3.如权利要求1所述的一种具有强热稳定性的甜味蛋白monellin突变体的制备方法， 其特征在于，包括以下步骤：

(1)构建野生型单链monellin蛋白表达载体；

(2)将步骤(1)中进行定点突变得到突变基因，挑取阳性转化子测序验证；

(3)将步骤(2)中测序正确的质粒转化入毕赤酵母中，筛选出成功转化的毕赤酵母；

(4)在YPD培养基中诱导表达蛋白，时间为3天；

(5)将步骤(4)中表达的蛋白纯化。

4.根据权利要求3所述的一种monellin蛋白突变体的制备方法，其特征在于，步骤(1) 为，构建含有野生型单链monellin蛋白基因的表达质粒PGAPZαA。

5.根据权利要求4所述的一种monellin蛋白突变体的制备方法，其特征在于，步骤(2) 突变位点特异性引物：上游P1：[5’-CCCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTGGTGAA-3’]；下游P2： [5’-CATACTGACCTATTTTGTTAGCCTCGTCAACAG-3’],上游P3：[5’-CTGTTGACGAGGCTAACAAAATAG GTCAGTATG-3’]；下游P4：[5’-TTGCGGCCGCTTAGGGAGGAGGCACAGGTCCGTTG-3’]。

6.根据权利要求5所述的一种monellin蛋白突变体的制备方法，其特征在于，步骤(2) 中，设计好引物后采用重叠PCR方法，根据以下体系进行PCR反应：

再以该PCR产物为模板用上游引物P1和下游引物P4按照上述PCR反应体系照如下程序 进行：

95℃预变性5min；95℃变性30s，51℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃终延伸 10min。

7.根据权利要求6所述的一种monellin蛋白突变体的制备方法，其特征在于，步骤(2) 中，用Xhol和NotI内切酶消化PCR产物经T4DNA连接酶连接到经两种酶处理后的PGAPZαA开 环空质粒上，转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂布于含25μg/mlZeocin的LLB固体培养 基上，过夜培养挑取阳性单菌落并提取质粒，测序验证突变结果，构建突变质粒PGAPZαA- E23A将正确的突变质粒保存备用。

8.根据权利要求7所述的一种monellin蛋白突变体的制备方法，其特征在于，步骤(3) 中所述的毕赤酵母为毕赤酵母GS115。