[发明专利]经血源宫内膜干细胞的分离培养方法

权利要求书

1.经血源宫内膜干细胞的分离培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1：获得经血；

步骤2：取所述经血稀释后获得经血稀释液，与分离液混合、离心；

步骤3：收集上清液清洗后，再与培养基混合，离心；

步骤4：收集沉淀，接种，培养。

2.根据权利要求1所述的分离培养方法，其特征在于，步骤2中所述稀 释为经PBS溶液按照体积比1∶1的比例稀释；

步骤2中所述分离液为Ficoll分离液，所述经血稀释液与所述分离液的体 积比为1∶(0.5～1)；

步骤2中所述离心为于700～800g离心15～30min。

3.根据权利要求1或2所述的分离培养方法，其特征在于，步骤3中所 述清洗为用PBS清洗2～4次；

步骤3中所述培养基为无血清培养基。

4.根据权利要求1至3任一项所述的分离培养方法，其特征在于，步骤 4中所述接种的密度为(7～8)×10⁵/ml。

5.根据权利要求1至4任一项所述的分离培养方法，其特征在于，步骤 4中所述培养为48h后半量换液，72h后全量换液，之后每3d换液1次，7～14d 在显微镜下观察到克隆的形成，当细胞生长至70～80％汇合时，胰蛋白酶消化。

6.根据权利要求5所述的分离培养方法，其特征在于，所述胰蛋白酶消 化为弃去培养基，清洗，加质量浓度为0.3～0.5％的胰蛋白酶消化，传代。

7.根据权利要求6所述的分离培养方法，其特征在于，所述消化的时间 为2～3min，终止消化，离心，用无血清培养基重悬细胞沉淀。

8.根据权利要求7所述的分离培养方法，其特征在于，所述终止消化采 用细胞体积3-5倍量的含5％FBS的培养基；

所述离心为1000rpm离心5min。

9.根据权利要求1至8任一项所述的分离培养方法，其特征在于，步骤 1中获得的经血采用经血保存液保存；所述经血保存液包括(2-5)×青霉素、 (2-5)×链霉素、30～50μg/ml卡那霉素、30～50μg/mL枸橼酸钠、100U/ml肝 素钠的磷酸盐缓冲液。

10.根据权利要求1至9任一项所述的分离培养方法，其特征在于，步 骤2所述与分离液混合和/或步骤3中所述清洗采用隔层离心管。