[发明专利]海洋弧菌指纹图谱的建立方法及其指纹图谱

说明书

技术领域

本发明涉及蛋白质分子指纹图谱技术领域，具体地，涉及用于检测83株海洋弧菌的指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱。

背景技术

美国流行病学调查显示近年来海洋弧菌的感染日益严重，人海洋弧菌感染大多数通过食用被弧菌感染的水产品或通过伤口接触含有海洋弧菌的水或其他载体而获得。水产养殖业中鱼类等水生动物的感染和水产养殖业工作者的感染影响着水产养殖业的经济发展和水产养殖业工作者的健康。弧菌鉴定涉及食品安全、水产品、海洋污染、水质检验等方面，因此海洋弧菌的快速鉴定尤其重要。

诊断海洋弧菌的金标准是以16SrRNA和rpoB为代表的分子生物学方法，但需要提取DNA，进行基因测序，费力耗时，且费用高。目前，对海洋弧菌的鉴定主要基于传统的微生物检测和生化鉴定，操作繁琐，周期长（平均7天），还有一些无法鉴定的非典型菌株。

因此迫切需要一种更加快速，可靠，高通量的鉴定方法来解决海洋弧菌在食品安全、水产品、海洋污染、水质检验及人类感染疾病等方面问题。

基质辅助激光解析飞行时间质谱（MALDI-TOF/TOFMS）方法是近年来出现的用于病原识别的方法，它用于微生物的检测和鉴定时，通过检测未知微生物的蛋白质指纹图谱并进行数据库检索，可以对细菌进行快速鉴定。可以将细菌鉴定至属、种和株的水平。许多国家的科研人员对该方法进行了验证，均表明MALDI-TOF/TOFMS满足现代传染病快速诊断的所有要求：快速、准确、易操作、廉价、高通量。根据质谱仪鉴定的原理，在质谱仪鉴定时，数据库的完善直接关系到鉴定结果的准确性。目前商业化的用于质谱的微生物鉴定系统有德国布鲁克公司的Biotyer系统及生物梅里埃的Saramis系统。但这两套商业化的数据库内弧菌标准肽谱很不完善，尤其是海洋弧菌甚少，无法准确的鉴定海洋弧菌。

发明内容

为了建立与完善MALDI-TOF/TOF质谱仪数据库内海洋弧菌的标准蛋白指纹图谱，增加海洋弧菌的种类，从而增加海洋弧菌鉴定的准确性，本发明提供了一种海洋弧菌指纹图谱的建立方法和标准的指纹图谱。

本发明提供了一种海洋弧菌特征蛋白指纹图谱数据库及其制备方法，包括以下步骤：从培养、DNA提取到鉴定、建库。建库所有菌均用16SrRNA、rpoB鉴定,16SrRNA、rpoB除了PCR扩增时所用引物不同，其余步骤均相同：

16SrRNA基因检测引物序列为：

27F：5’-AGAGTTTGATC(C/A)TGGCTCAG-3’

1492R:5’-TACGG(C/T)TACCTTGTTACGAC-3’

rpoB基因检测引物序列：

F1:5’AGGCGTGTTCTTCGACAGCGATAA3’

R1:5’TCGTCCACTTCGCCTTTACC3’

复苏83株海洋弧菌，培养温度为28℃。

提取细菌基因组DNA：无菌EP管中加入50μl无菌水，挑取单个菌落于其中充分混匀，调制菌液至1-2浊度，震荡15秒钟；置100℃沸水中煮沸10min，取出后于冰上放置10分钟；13000转离心5分钟，取上清液约30μl即为DNA提取液。

PCR扩增：PCR扩增体系（共50μl）为2×PCRmixTaq25μl；上游引物1μl；下游引物1μl；去离子水20μl；DNA模板1μl。PCR反应参数为：94℃8min（预变性）；94℃40s（变性打开双链）；55℃40s（退火）；72℃1min30s（延伸）；72℃8min（延伸）；循环30次，产物4℃保存。

PCR扩增产物琼脂糖电泳检测：将上样梳固定于胶槽内，将制备好的胶液倒入胶板内，使胶液缓慢展平，确保没有气泡后，将胶槽于室温放置使胶液完全凝固；胶液完全凝固后，将凝胶置于电泳槽内，添加1×TAE电泳缓冲液至没过胶板1-2mm；取9μlPCR产物与1μl10×loadingbuffer混匀后，加入胶孔内，100V电泳30分钟；将电泳后的凝胶于紫外线下观察，16SrRNA基因的条带位于1500bp处左右，rpoB基因的条带位于800bp左右。取阳性结果PCR产物送INVITROGENTRADING(SHANGHAI)CO.LTD.公司测序。