[发明专利]海洋弧菌指纹图谱的建立方法及其指纹图谱

权利要求书

1.一种海洋弧菌指纹图谱的建立方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）在EP管中加入300ul去离子水；取待测微生物样本一个独立菌落至EP管中，充分混匀；加入900ul乙醇，充分混匀；13000rpm离心2分钟，倒去上清，再次离心，移去上清，室温下干燥沉淀2-3分钟；加入70%甲酸水溶液10ul，充分混合；加入纯乙腈10ul，充分混匀；13000rpm离心2分钟，上清液即为制备的蛋白样品；

2）将上述蛋白样品分别上质谱仪样品靶，样品干燥后，覆盖基质，所述基质为α-氢基-4-羟基肉桂酸在50％乙腈、2.5％三氟乙酸中的饱和液打开质谱仪舱门把靶板放进去；

用标准品进行仪器校正，设定参数对蛋白质指纹图谱进行标准化处理；采集2000-20000Da范围内的肽图谱，即为海洋弧菌的指纹图谱。

2.根据权利要求1所述的海洋弧菌指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述质谱仪为MALDI-TOF质谱仪，氮激光器波长377nm,质量采集范围2000至20000Da，源1电压,20kV,源2电压,18.5kV,透镜电压,8.45kV；延时提取,320ns；激光频率20Hz，调整总采集频次使谱图总强度大于10000。

3.根据权利要求1所述的海洋弧菌指纹图谱的建立方法，其特征在于，步骤2）中标准品的制备方法为：每管标准品加125μl0.1%TFA溶解，涡旋，混匀；分装，每管5μl，

-20°C保存；用TA30按1:5或者1:10稀释储备液；取1μl稀释后的蛋白标准品I和1μl饱和CHCA或者饱和SA基质溶液混合后，点在groundsteel或者polishedsteel靶板上，自然干燥。

4.根据权利要求1所述的海洋弧菌指纹图谱的建立方法，其特征在于，采集肽图谱方法具体为：每株菌制备到靶板的8个靶位上；每个靶位采图3张，每张图轰击100次激光；将获得的24张图谱在flexanalysis中打开，除去低质量的图谱；将大于20张的有效图谱在Biotyper中打开。

5.根据权利要求1所述的海洋弧菌指纹图谱的建立方法，其特征在于，所述的标准化处理为：归一化、基线修正、平滑、去噪；通过设定MSP参数，质量偏差小于0.02%、信噪比大于3、峰出现频率最小值25%，最多峰数目70，每个种的细菌由24张谱图构建标准参考谱，并通过MSP自带统计学方法提取特征峰。