[发明专利]四倍体青贮玉米倍性的早期鉴定技术

说明书

一、技术领域

本发明涉及一种四倍体青贮玉米的倍性鉴定方法，属于生物技术领域。

二、背景技术

玉米是重要的粮饲兼用型作物，以其产量高、营养丰富而被誉为饲料之王。我国玉米总需求量的78％用作畜禽饲料。随着人民生活水平提高，牛、羊等食草动物产品受到人民的普遍青睐，养殖规模不断扩大，对青贮饲料的需求量逐年上升。随着畜牧业的发展和种植结构的进一步调整，饲用玉米尤其是青贮玉米越来越受到人们的重视。四倍体玉米因其具有较大的株型、宽大肥厚的叶片、粗壮的茎和根以及多果穗等特性，是极佳的青贮饲料来源。然而，我国四倍体青贮玉米育种研究较少，检测技术更是空白。

四倍体玉米形态学性状与二倍体玉米有明显差别，但是不能作为准确鉴别二倍体和四倍体玉米的标准。通过显微观察来鉴定个体的染色体倍性的主要方法包括：根尖染色体计数法、花粉粒大小判别法、气孔保卫细胞叶绿体计数法、保卫细胞长度测量法等(刘仁样，1998；王培，1989)。这些显微观察方法不但费时，而且技术难度大。采用保卫细胞长度测量法，由于二倍体和四倍体的保卫细胞长度重叠，会造成测量结果的不准确。而采用花粉粒大小判别法需在开花期进行，不但费时费工，还受花粉时间限制。

目前，流式细胞术(Flow CytoMetry，FCM)己普遍应用于免疫学、血液学、肿瘤学、细胞生物学、细胞遗传学、生物化学等临床医学和基础医学研究领域，但在植物方面的应用直到20世纪80年代中期才开始。由于流式细胞仪可以直接测定细胞的DNA含量，从而快速鉴定出植株倍性水平，不受植株生长发育时期和环境条件的影响，省时、高效，还可以检测出非整倍体以及混倍体。并已被成功地用于大白菜(韩阳，2006)、水稻(金亮，2007)、黑麦草(刘祎，2011)、葡萄(郭印山，2014)倍性鉴别上，但至今还未见该方法用于玉米倍性鉴定的报道。应用流式细胞仪进行玉米苗期倍性分析将提高鉴定效率。

三、发明内容：

本发明涉及一种玉米苗期倍性的鉴定方法，现有技术不能有效、快速鉴定四倍体青贮玉米，建立四倍体青贮玉米的流式细胞仪倍性鉴定体系，可以在苗期有效去除杂株，加速育种材料的选育。

1.鉴定方法：

(1)细胞核分离缓冲液制备及待测样品的处理

OTTO buffers分离缓冲液配置：OTTO I：100mmol/L柠檬酸，0.5％(V/V)Tween 20(pH2.3)；OTTO II：400mmol/L Na₂HPO₄·12H₂O(pH8.9)。

取100mg叶片加入1ml OTTO I中，用剪刀将叶片剪碎，冰孵5-10min，8000r/min离心5min，弃上清，加入1ml OTTO I 1000r/min离心5min，弃上清，加入100μl OTTO I和200μl OTTO II混合液，过300目筛子，加入终浓度为50μg/ml PI染液，暗处理染色15min，过500目筛子，上机检测。

(2)流式细胞仪倍性鉴定

采用美国Becton-Dickinson公司的FACSCalibur流式细胞仪，其激发光源为488nm氩离子蓝色激光；经激发，染色的DNA分子促发荧光，检测器测定荧光强度，光信号到达检测器生成电脉冲信号，电子系统对电脉冲信号进一步处理得到图像信号；用仪器附带软件获取数据并显示直方图，计算G_0/1峰的变异系数(CV(％)＝标准差/平均数×100)，一般CV值小于3％表示结果准确，CV值小于5％基本准确。将对照二倍体植株主峰荧光强度调至200通道处，如待测植株主峰值处在200通道处视为二倍体，而处在400通道处视为四倍体。

2.有益效果

本发明将流式细胞仪应用于玉米幼苗倍性的鉴定，建立四倍体青贮玉米的流式细胞仪倍性鉴定体系。与目前技术相比，其优点是：

(1)该方法不受细胞所处时期限制，玉米幼苗长至4～5叶，取100mg玉米新鲜叶片，不需要过多的处理步骤，即可检测；

(2)测试速度快，仅用几分钟就可以分析上万个细胞，测定出单个细胞核内DNA含量，并且DNA含量变异可在分布图上直观地看出；

(3)灵敏度、分辨率及准确性较高，数据的可重复性好，特别适合于样品较多的玉米倍性检测分析。

四、附图说明

图1为以普通二倍体玉米为对照叶片的DNA含量直方图

图2为二倍体青贮玉米叶片的DNA含量直方图。