[发明专利]一种测定植物组织氨基酸泄漏率的方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物抗逆性鉴定技术，具体是指一种测定植物组织氨基酸泄漏率的方 法。

背景技术

受全球气候变暖的影响，环境变化程度增大，春夏季寒流天气频繁，对已进入生长 发育期的植物造成严重威胁，引起草原植被群落的变迁和结构的改变，尤其在农业生产中 造成很大的减产，甚至绝收。另外，在农业生产过程中，随着化肥的投入使用，土壤盐碱化问 题愈加突出，对农作物造成一定程度的盐害，严重影响农业生产。抗逆性强的植物在逆境胁 迫中产出性能强，减产小。因此，通过选育抗逆性强的植物新品种是改良植物抗逆性，保持 农牧业增收的有效途径。

植物抗逆性快速鉴定的方法是植物抗逆育种的关键技术，一直受到研究者的关 注，但传统的形态鉴定法不能对抗逆性进行量化分析，分子鉴定技术成本高，操作难度大且 耗时，要求精密仪器才能完成。电导率法虽然能反映细胞的完整性，但测定时误差难以控 制。由于植物细胞为双磷脂分子层通透性膜，中间镶嵌大量蛋白质和糖类分子，具有渗透调 节功能，也具有双向选择透性。当植物受到低温冷冻、盐碱非生物环境因子胁迫后，机体内 抗氧化系统失衡，自由基积累，一些蛋白质被降解为游离氨基酸，膜蛋白降解后从生物膜脱 落下来，破坏了生物膜系统结构，造成生物膜不同程度出现孔洞，细胞内含物开始向外泄 露，介质中游离氨基酸增多。不同程度的环境胁迫引起蛋白质降解的程度不同，造成氨基酸 泄露的程度就不同。然而，抗逆性强的植物具有较强的抗氧化系统，能及时清除多余的自由 基，维持体内自由基的稳定和平衡，保护功能蛋白质不被降解，保持膜系统的完整性。因此， 当植物遭到逆境胁迫后，抗逆性强的植物生物膜系统稳定，蛋白质相对稳定，氨基酸泄露率 低。根据自由基学说、生物膜损伤原理和蛋白质稳定性原理，可通过测定植物组织细胞氨基 酸泄漏的程度，来衡量生物膜系统的完整性和蛋白质的稳定性，这对于鉴定植物的抗逆性 和选育抗逆性强的植物新品种均有着实际的应用价值。

发明内容

鉴于上述，本发明的目的在于提供一种测定植物组织氨基酸泄漏率的方法。本方 法利用氨基酸在280nm处有一吸收高峰为依据，以杀死组织后280nm吸光度为参照，通过试 验准备-准备样品-浸提-离心-去除杂蛋白干扰-测定鲜组织吸光度-高压灭杀-合并离心- 测定杀死组织吸光度，最后计算氨基酸泄露率。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现：

一种测定植物组织氨基酸泄漏率的方法，其步骤是：

a．试验准备

根据试验处理数，准备足量5-10ml带螺盖离心管，用无离子水洗净后烘干备用；

b．准备样品

处理前用蒸馏水冲洗待测植物组织，用滤纸吸干表面水分；处理结束，准确称取各处 理植物新鲜组织0.0401-0.0509g，置a步骤准备的离心管中；

c．浸提

在b步骤含植物新鲜组织的离心管中各加入4mL蒸馏水，在室温条件下，浸提2-3h，摇 床轻摇浸提3h；

d．离心

浸提结束，立即将c步骤的浸提管放置在转速为3000rev/min的离心机离心5-10分钟；

e．去除杂蛋白干扰

上述d步骤离心结束，吸取浸提管中的上清液3.0ml,转入另一测试管，加入0.3ml的 72%（w/v）三氯乙酸（TCA）溶液，再在3000rev/min离心5-10分钟，以沉淀去除杂蛋白干扰；

f．测定鲜组织的吸光度

将e步骤离心后的测试管上清液倒入比色杯，在紫外分光光度计读取波长280nm的吸光 度值A280nm，空白为蒸馏水，获得鲜组织在波长280nm的吸光度值A280nm，测定后将比色杯 液体倒回测试管中；

g.高压灭杀

将e步骤吸取上清液后留有植物组织和1ml浸提液的浸提管上盖置高压灭菌锅灭杀 20min，浸提管称之灭杀管；

h.合并离心

将e步骤测试管测试液全部回倒入其g步骤对应灭杀管中，合并后再在3000rev/min离 心5-10分钟，以沉淀去除杂蛋白干扰；

i.测定杀死组织的吸光度

将上述h步骤合并离心的灭杀管上清液倒入比色杯，空白为蒸馏水，再次测定吸光度值 A_k280nm，即为杀死样品在波长280nm的吸光度值A_k280nm；

j．计算氨基酸泄漏率