[发明专利]一种牙鲆CD59抗菌肽的重组表达和纯化复性方法

权利要求书

1.一种牙鲆CD59抗菌肽，其特征在于，所述的抗菌肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。

2.编码权利要求1所述的牙鲆CD59抗菌肽的核酸片段，其特征在于，所述的核酸片段的序列为SEQ ID NO:2。

3.一种重组表达权利要求1所述的牙鲆CD59抗菌肽的方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：

1)重组质粒的构建

将携带有权利要求2所述的核酸片段的pMD18-T质粒与pET32a(+)质粒均用EcoRI和XhoI双酶切后，酶切产物分别回收，并进行连接，得到用于表达序列为SEQ ID NO:1的牙鲆CD59抗菌肽的重组质粒；

2)重组蛋白的诱导表达

将步骤1)制备的重组表达载体转化进宿主菌BL21(DE3)pLysS中，用含抗生素的LB培养基扩大培养后，在添加有抗生素的LB平板中培养，进行PCR检测，筛选转化入重组表达载体的BL21(DE3)pLysS工程菌株；

将挑取的工程菌株单克隆接种于LB培养液中37℃培养过夜；将活化菌接种于2×YT培养液中，37℃震荡培养，当OD600为0.6左右时加诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷至终浓度1mM，37℃诱导表达3h，菌液经12,000rpm，离心10min收集细胞；

3)重组蛋白的分离纯化

将收集的细胞加入裂解液重悬细胞，并超声波破碎细胞，12000rpm，离心10min收集裂解上清及沉淀；将包涵体蛋白用8M尿素溶解后过Ni柱纯化；

4)重组蛋白的复性

将透析袋用NaHCO₃/EDTA溶液煮沸处理，用灭菌三蒸水洗涤透析袋；将要复性的重组蛋白浓度用溶解液稀释到0.1mg/ml-0.2mg/ml；将其转入透析袋中，将提前预冷的透析液I倒入烧杯中，将装好的透析袋放入烧杯并将烧杯移入冰盒中，放到磁力搅拌器上慢速搅拌，冰浴透析12h；

将透析袋移至提前预冷的透析液II中，冰浴搅拌透析12h；

将透析袋移至提前预冷的透析液III中，冰浴搅拌透析12h；

将透析袋移至提前预冷的透析液IV中，冰浴搅拌透析12h；

将透析袋移至提前预冷的透析液V中，冰浴搅拌透析12h；

将透析袋移至提前预冷的透析液VI中，冰浴搅拌透析12h；

将透析袋移至提前预冷的透析液VII中，冰浴搅拌透析12h；

完成透析后，从透析袋中吸出重组蛋白溶液，浓缩后加入终浓度为5％的甘油，-80℃冻存备用；

所述的透析液的组成如下：

透析液Ⅰ：Tris 25mM,NaCl 200mM,EDTA 1mM,尿素5M,DTT 5mM,pH 8.0；

透析液Ⅱ：Tris 25mM,NaCl 50mM,EDTA 1mM,尿素4M,GSSG 0.2mM,GSH 2mM,pH 8.0；

透析液Ⅲ：25mM Tris,20mM NaCl,1mM EDTA,2M尿素,0.5mM GSSG,1mM GSH,pH 8.0；

透析液Ⅳ：Tris 25mM,NaCl 10mM,EDTA 1mM,尿素1M,甘油5％,DTT 5mM,GSSG 1mM,GSH1mM,pH 8.0；

透析液Ⅴ：Tris 25mM,NaCl 10mM,EDTA 1mM,0.5M尿素,5％甘油,1％甘氨酸,DTT 5mM,GSSG 1mM,GSH 1mM,pH 8.0；

透析液Ⅵ：Tris 25mM,NaCl 10mM,5％甘油,1％甘氨酸,DTT 5mM,pH 8.0；

透析液Ⅶ：Tris 25mM,NaCl 10mM,pH 8.0。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述的步骤2)中PCR检测所用的引物的序列信息如下：

P1:5′-GAATTCCTGACGTGCAACTACTGTTACTC-3′、

P2:5′-CTCGAGTAATGGCGCCAAGCTGAGGTG-3′。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述的步骤3)中的裂解液的组成如下：50mM的Tris-Hcl，20mM的EDTA，100mM的Nacl，0.5％的Triton-100。

6.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述的步骤4)中的NaHCO₃/EDTA溶液的组成如下：10mM的NaHCO₃、1mM的EDTA。