[发明专利]稳定分泌近红外荧光标记外泌体的乳腺癌细胞株的制备

说明书

本发明公开了一种稳定分泌近红外荧光标记外泌体的乳腺癌细胞株的制备方法，通过构建一种融合表达近红外荧光iRFP682蛋白和CD63蛋白的质粒载体，然后用此质粒包装的重组腺相关病毒(rAAV)和辅助病毒以一定比例共感染人乳腺癌MDA‑MB‑231细胞，筛选获得能稳定表达近红外荧光蛋白iRFP682标记的外泌体的人乳腺癌MDA‑MB‑231细胞，然后采用分步离心法分离提纯近红外荧光蛋白iRFP682标记的外泌体进行鉴定。本发明最终得到一个可用于乳腺癌肿瘤微环境体内体外研究的新型生物标志物，为进一步研究细胞间物质转移机制提供了有力工具，同时也给癌症的诊断和治疗方案提供新的支持和契机。

技术领域

本发明涉及生物标记领域。更具体地说，本发明涉及一种稳定分泌近红外荧光标记外泌体的乳腺癌细胞株的制备。

背景技术

1986年，有学者在体外培养的绵羊红细胞上清液中发现了一种有膜结构的小囊泡，被称之为外泌体。至1996年，有学者发现EB病毒转化的人B细胞内一些有膜结构的小囊泡表面可表达主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)Ⅱ类分子，能激活T细胞，并与红细胞内外泌体的形成过程和排出途径相似(参见Van Niel G,Porto-Carreiro I,Simoes S,Raposo G.Exosomes:a common pathway for aspecialized function.J Biochem2006,140:13～21)，自此之后，人们开始对外泌体展开广泛的研究。外泌体是由活细胞分泌的来源于晚期核内体(也称为多囊泡体)的直径为30～120nm的膜性囊泡(参见Stoorvogel W,Kleijmeer MJ,Geuze HJ,Raposo G.Thebiogenesis and functions of exosomes.Traffic 2002,3:321～330)。目前的研究方向主要有干细胞、免疫、microRNA和靶向给药。2013年诺贝尔生物/医学奖授予了三位在细胞囊泡方面贡献突出的科学家，推动外泌体的研究达到全新的高度。