[发明专利]稳定分泌近红外荧光标记外泌体的乳腺癌细胞株的制备

权利要求书

1.一种稳定分泌近红外荧光标记外泌体的乳腺癌细胞株的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)编码外泌体标记蛋白CD63基因的获得：

从人乳腺癌MDA-MB-231细胞中提取总RNA进行逆转录得到cDNA，用带XbaI和ClaI酶切位点，以及Linker序列的引物进行PCR扩增得到目的基因片段CD63-Linker；所述Linker序列为：ggtggaggcggttcaggcggaggtggctctggcggtggcggatcg；

2)重组质粒载体的构建：

步骤1)得到的所述CD63-Linker和质粒骨架pAAV-iRFP682经T4DNA连接酶作用得到重组质粒载体pAAV-CD63-Linker-iRFP682；

其中，所述CD63-Linker和质粒骨架pAAV-iRFP682的摩尔比例为2～5；

3)重组腺相关病毒的制备：

使用所述重组质粒载体pAAV-CD63-Linker-iRFP682和辅助质粒体外共转染AAV-293细胞，包装重组腺相关病毒rAAV-CD63-Linker-iRFP682；

所述辅助质粒为pDG质粒；

4)稳定分泌近红外荧光蛋白标记外泌体的乳腺癌细胞株的制备：

使用所述重组腺相关病毒rAAV-CD63-Linker-iRFP682和辅助腺相关病毒共感染人乳腺癌MDA-MB-231细胞，通过荧光筛选获得稳定分泌近红外荧光蛋白标记外泌体的人乳腺癌MDA-MB-231细胞株；

其中，所述辅助腺相关病毒为rAAVSVAV2；所述重组腺相关病毒与所述人乳腺癌MDA-MB-231细胞数目的比例是3000～6000；

5)近红外荧光标记人乳腺癌MDA-MB-231细胞的外泌体提取及鉴定：

采用分步离心法从步骤4)标记成功的MDA-MB-231细胞培养上清液中提取iRFP682标记的外泌体并进行鉴定；

所述步骤5)中分步离心法的步骤为：

首先将所述细胞培养上清液在4℃条件下依次经2000g离心15min、5000g离心15min及12000g离心30min去除细胞碎片，得第一上清液；

然后将所述第一上清液使用孔径不大于0.2μm的膜过滤后，4℃、12000g条件下离心120min，得到外泌体粗沉淀；

最后用PBS溶液重悬所述外泌体粗沉淀，混合均匀后于4℃、12000g条件下离心90min，得到提纯外泌体，将所述提纯外泌体使用PBS溶液重悬后置于-80℃条件保存备用；

所述步骤5)中iRFP682标记的外泌体鉴定的方法为：使用western blot鉴定所述外泌体的膜表面蛋白，通过透射电镜观察所述外泌体的结构，以及通过SIM结构光照明超分辨荧光显微镜观察外泌体的荧光标记。