[发明专利]蜂素信号肽介导鸡传染性支气管炎病毒N蛋白分泌表达的方法

权利要求书

1.一种蜂素信号肽介导鸡传染性支气管炎病毒N蛋白分泌表达的方法，其特征在于先 获取融合蜂素信号肽的鸡传染性支气管炎病毒N基因HBM-N，然后构建重组转移载体pFast- HBM-N和重组杆粒rHBM-N，最后将重组杆粒转染Sf9昆虫细胞用于分泌表达鸡传染性支气管 炎病毒N蛋白。

2.根据权利要求1所述的蜂素信号肽介导鸡传染性支气管炎病毒N蛋白分泌表达的方 法，其特征在于：所述获取融合蜂素信号肽的鸡传染性支气管炎病毒N基因HBM-N采用的N基 因扩增引物和蜂素信号肽的扩增引物分别为：

上游引物N-F5′-CATTTCTTACATCTATGCGGATCGAATGGCAAGCGGTAAAGCAGCT-3′，

下游引物N-R5′-CGGGGTACCTCAGTGATGGTGATGGTGATGGCCTTGAAAGTACAAGTTTTCAAGTTCA TTCTCTCCAAGTGCTGAATCG-3′；

上游引物HBM-F5′-CCGCTCGAGATGAAATTCTTAGTCAACGTTGCCCTTGTTTTTATGGTC-3′，

下游引物HBM-R5′-TCGATCCGCATAGATGTAAGAAATGTATACGACCATAAAAACAAGGGC-3′。

3.根据权利要求1所述的蜂素信号肽介导鸡传染性支气管炎病毒N蛋白分泌表达的方 法，其特征在于包括以下步骤：

(1)HBM-N的获取

对感染鸡传染性支气管炎病毒GX-YL5株的SPF鸡胚尿囊液进行总RNA抽提，反转录获得 cDNA，以cDNA为模板，采用上下游引物N-F和N-R进行PCR扩增，获得鸡传染性支气管炎病毒N 基因；再利用蜂素信号肽上下游引物HBM-F和HBM-R扩增出完整的蜂素信号肽HBM；然后以蜂 素信号肽和N基因为模板将两段基因进行融合，获得融合蜂素信号肽的基因HBM-N；

(2)构建重组转移载体pFast-HBM-N

将步骤(1)获得的目的基因HBM-N定向插入pFastBac^TMDual载体中，获得的阳性质粒即 为重组转移载体pFast-HBM-N；

(3)构建重组杆粒rHBM-N

将步骤(2)获得的重组转移载体pFast-HBM-N转化DH10Bac^TM感受态细胞，通过Kan、Tet、 Gen三种抗生素，IPTG、X-gal蓝白斑筛选，挑取阳性菌多次划板获得纯化重组杆粒rHBM-N；

(4)重组杆粒rHBM-N转染Sf9细胞

将重组杆粒rHBM-N利用脂质体介导转染Sf9细胞，用于分泌表达鸡传染性支气管炎病 毒N蛋白。