[发明专利]一种透明质酸酶细胞表面展示系统及其制备和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种透明质酸酶细胞表面展示系 统及其制备和应用。

背景技术

透明质酸(hyaluronicacid，HA)，是由重复连接的[-D-葡萄糖醛酸-N-乙酰 葡萄糖胺-]_n双糖单位组成的酸性黏多聚糖。HA广泛存在于细菌的荚膜、动物组 织的间隙以及昆虫的毒液中，由于其粘弹性高、可塑性以及持水性强、生物吸收 性好，故广泛应用于化妆品、医药、食品等领域。HA的生物活性与其相对分子 量直接相关，目前市场上所用HA的相对平均分子质量大都大于10⁶Da。低分子 量HA(LMWHA)的相对分子质量在(1～8)×10⁴Da之间，寡聚HA(o-HA)的 相对分子质量小于10⁴Da，LMWHA和o-HA具有抗肿瘤、免疫调节、促进伤口 愈合以及促进骨和血管生成的作用，在医学中有不可小觑的应用价值。

目前，生产LMWHA和o-HA的方法有化学降解法、物理降解法、酶解法以 及生物合成的方法。化学降解法以及物理降解法反应条件剧烈，不仅破坏HA的 分子结构，也会对D-葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡糖的结构造成破坏，影响了 LMWHA与o-HA的生物活性。而生物合成的方法其反应条件严格，可控性不好， 生产成本太高，不适用于工业生产。

市场上常见的是用透明质酸酶酶解法生产LMWHA与o-HA，透明质酸酶 (HAase)是可以降解HA的酶，在自然界中分布十分广泛，在哺乳动物、无脊椎 动物、病原性真菌、细菌和噬菌体中均有发现。透明质酸酶主要是从动物组织中 提取或通过基因工程菌表达后纯化获得，但无论是从动物组织中提取的透明质酸 酶或是用细菌在胞内表达或分泌到胞外表达的透明质酸酶，其纯化步骤都比较繁 琐，并且降解HA时不易与反应产物分离。

细菌细胞表面展示通常指通过DNA重组技术，将某一具有特定功能的外源 蛋白的编码基因与受体细菌细胞表面的锚定单元的编码基因融合后，通过融合蛋 白在受体细胞中表达、分泌以及与细胞表面特定结构成分之间的识别，所表达的 融合蛋白最终锚定在宿主细胞的表面，以达到研究或应用的目的。锚定于细胞表 面的外源蛋白可以克服某些大分子底物不能直接穿越细胞膜进入胞内反应位置， 以及某些反应产物在胞内无法正确折叠等弊端。细胞表面展示的外源蛋白能与细 胞外环境中的特定反应底物直接接触并发生作用，从而大大提高反应效率；同时， 通过设计简便的胞外制备流程即可提取反应产物，从而免去某些产物通常不得不 从细胞内提取与纯化等一系列复杂低效的操作过程。冰核蛋白(ice-nucleation protein，INP)是丁香假单胞菌等菌株的外膜蛋白，可加速纯水的冰晶形成。INP通 过糖基磷脂酰肌醇而锚定在细菌表面，利于大分子蛋白的表面呈现。

发明内容

本发明主要提供了一种透明质酸酶细胞表面展示系统，将其应用于制备低 分子量透明质酸和寡聚透明质酸。其技术方案如下：一种重组透明质酸酶细胞 表面展示系统，具体的为，将编码透明质酸酶的基因hyl和负责跨膜定位和转运 的冰核蛋白N端结构域的基因inaQ-N融合得融合后的基因片段，表达于宿主 细胞表面，得到透明质酸酶细胞表面展示系统；

基因hyl具有SEQIDNO：1所示的核苷酸序列；

基因inaQ-N具有SEQIDNO：2所示的核苷酸序列。

优选的，所述编码透明质酸酶的基因来源于兽疫链球菌，所述宿主细胞为 Escherichiacoli宿主菌。

一种重组透明质酸酶细胞表面展示系统的制备方法，包括以下步骤：

(1)将SEQIDNO：1所示的编码透明质酸酶的基因hyl和SEQIDNO：2 所示的负责跨膜定位和转运的冰核蛋白N端结构域的基因inaQ-N融合，得融 合后的基因片段；

(2)验证融合后的基因片段的序列；

(3)将经验证的融合后的基因片段插入温度诱导型表达质粒中，得到重组 的温度诱导型表达质粒；

(4)将重组的温度诱导型表达质粒转化入宿主菌，转化有所述重组的温度 诱导型表达质粒的宿主菌成为所述重组透明质酸酶细胞表面展示系统；

(5)在温控诱导下使所述重组透明质酸酶展示在所述细菌细胞表面。

优选的，步骤(3)中所述的温度诱导型表达质粒是指含有PL启动子的温 度诱导型表达质粒。