[发明专利]一种水蛭多肽的分离纯化方法

说明书

本发明公开了一种水蛭多肽的分离纯化方法，首先将水蛭提取物加入模仿人体肠细胞吸收的系统中培养，然后将被吸收的物质进行层析分离即可。本发明的发明人从不同的角度解决了水蛭多肽的分离纯化男的问题，通过将水蛭提取物首先采用Caco‑2细胞进行纯化，模仿了中药水蛭在体内的消化吸收过程，经过模拟肠道细胞的吸收作用，将大量的不能被人体肠道细胞吸收的多肽首先分离出来，简化了分离纯化过程，然后再经过阴离子交换柱层析和凝胶过滤层析既可以分离纯化得到能被人体吸收利用的多肽。通过本发明的方法分离纯化得到的多肽具有抑制血管平滑肌细胞迁移的作用。

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及一种水蛭多肽的分离纯化方法。

背景技术

动脉粥样硬化是由于脂质在动脉血管壁中大量堆积而导致的动脉管壁增厚、变硬，进而使动脉失去弹性、管腔狭窄。它是一种由多种细胞及细胞因子共同参与的慢性炎性疾病。随着对动脉粥样硬化病变过程研究的不断深入，动脉粥样硬化相关细胞间的相互作用以及细胞因子与细胞的相互作用等炎症因素被越来越多的研究。参与动脉粥样硬化的细胞主要包括：血管内皮细胞，血管平滑肌细胞以及免疫细胞，其中免疫细胞主要为巨噬细胞，此外还有中性粒细胞、肥大细胞、树突细胞以及T细胞等。

血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMCs)的增殖、迁移在动脉粥样硬化病变的形成过程中也起着关键性的作用。VSMCs是血管壁的重要构成成分，主要位于血管中膜，生理条件下，VSMCs的增殖和凋亡之间保持平衡，而在许多病理状态下可使其增殖失控，从而引起血管壁的一系列变化。血管内膜中仅存在少量VSMCs，其主要作用是通过舒张和收缩改变血管直径，使血管保持适当的血流压力，此时的VSMCs表现为收缩型，其增殖及合成能力很低。在多种病理因素的作用下，VSMCs的表型可由收缩型转化为合成型。合成型的VSMCs能够合成和分泌大量细胞外基质，从而改变细胞周围的微环境，而细胞外基质又可影响VSMCs的增殖、黏附和迁移过程。炎性反应可刺激VSMCs发生迁移、增殖，并与炎性病变内的炎性成分相互作用，使动脉壁增厚。单核细胞的蓄积、VSMCs增殖和纤维组织形成导致病变进一步扩大并重组成为覆盖在脂质核心和坏死组织上的纤维帽，最终导致斑块复合型病变的形成。因此，VSMCs也是推动动脉粥样硬化进程的关键细胞之一。

水蛭(Leech)作为传统中药用于治疗多种疾病，在我国古代医书中多有记载。例如《神农本草经》中谓其“主逐恶血、瘀血、月闭、破血消积聚……”。水蛭药理作用广泛，包括抗凝、抗血栓、抗肿瘤、抗炎、内皮细胞保护以及抗纤维化等。在心脑血管疾病临床治疗中，中药水蛭及含有水蛭的中成药或复方制剂已广泛应用于冠心病、心绞痛、急性心肌梗塞、缺血性脑中风(如脑血栓、脑梗塞及其后遗症)、高血压、高血脂、脑动脉粥样硬化等疾病、动脉粥硬化及周围血管病等疾病的防治。近年来关于水蛭防治心脑血管疾病的基础研究不断深入。国内对水蛭药理作用的研究报道主要包括三个方面：抗凝作用，对心脑血管疾病的治疗作用，对糖尿病视网膜病变的治疗研究。但是由于水蛭多肽的复杂性和活性筛选的难度，目前没有简便的活性水蛭多肽的分离纯化方法。

发明内容

本发明的目的就是为了提供一种水蛭多肽的分离纯化方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种水蛭多肽的分离纯化方法，首先将水蛭提取物加入模仿人体肠细胞吸收的系统中培养，然后将被吸收的物质进行层析分离即可。

优选：水蛭提取物的提取方法如下：

取水蛭干燥全体粉碎成20-150目粉末，加入6-16倍重量的水，或者水蛭鲜活全体，加入1-6倍重量的水，匀浆；取匀浆液，调节pH至7-9，按每1g水蛭干药材加入2000-20000U酶的比例加入胰蛋白酶，控制温度40-60℃，酶解2-12小时，冷却至室温；酶解完后，向上述酶解液中加入1-5倍体积的丙酮或者乙醇冷藏沉淀4-12小时，过滤，滤液减压干燥，得水蛭提取物。