[发明专利]CXCL1的适配体在制备检测上尿路上皮癌试剂中的应用

说明书

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及CXCL1适配体在制备检测上尿路上皮癌试剂中的应用。

背景技术

所谓尿路上皮癌是指膀胱癌和肾盂癌、尿管癌等的总称，上述癌均由尿路的移行上皮细胞癌化产生，一般认为其性质是相同的。尿路上皮癌是在泌尿生殖器癌中继前列腺癌之后患病人数最多的癌症。

已经公开了用于膀胱癌的检查和确定的多种标记物及方法。例如可以举出通过核磷蛋白(nucleophosmin)/B23、HURP、CYP4B1或CYP4B2等基因表达水平的变化来确定膀胱癌的方法，通过尿样中特定蛋白质的存在或量来确定膀胱癌的方法，以血液中可溶性Fas浓度为指标确定膀胱癌的方法等。在现有技术中以CXCLl蛋白质作为肿瘤标记物，通过使用与其特异性结合的抗体、或者能够与编码该蛋白质的基因、其转录产物或其cDNA结合的核酸，能够有意义地检测出尿路上皮癌。

核酸适配子(aptamer)是一种生物大分子的人工单链寡核苷酸配体,通过SELEX(SystematicEvolutionofLigandsbyExponentialEnrichment)技术从随机单链寡核苷酸文库中筛选获得。SELEX技术(即系统进化指数富集技术)是20世纪90年代初研制/发展起来的一种新的组合化学技术，其运用大容量的随机寡核苷酸文库，结合体外PCR扩增技术，以指数富集与靶分子特异结合的寡核苷酸，经过多轮筛选，获得亲和力高、特异性强的核苷酸适配子(aptamers)。该技术己成功运用于许多靶分子的筛选，包括金属离子、有机染料、药物、蛋白质、氨基酸以及各种细胞因子等。这种方法具有简便、快速、经济等特点，与其他组合化学库如随机肤/肽库、抗体库和噬菌体表面展示文库相比，从寡核苷酸文库中筛选出的适配子具许多优势：a.本身是寡核苷酸，分子量较小，可以化学合成，节约成本。b.具有比抗体更高的亲和性和特异性。c.便于标记，可以在不同部位有选择性的标记。d.重复性好，稳定性好，易于保存，对高温和剧烈条件不敏感。因此，寡核苷酸适配子/SELEX技术具有良好的应用前景，特别是在抗体工程领域。消减SELEX技术是识别癌与非癌细胞间微小差异、筛选癌细胞特异性亲和适配子的有力工具。

核酸适配子筛选的基本步骤如下:设计并合成随机单链寡核苷酸文库；将文库与靶标共孵育，使文库中能与靶标特异性结合的寡核酸与靶标形成复合物，分离复合物并洗脱寡核酸，以洗脱的寡核酸为模板进行PCR扩增，制备成新的单链随机寡核苷酸文库，开始下一轮筛选；重复数轮孵育-洗脱-扩增，与靶标高特异性和高亲和力结合的核酸序列将从文库中筛选出来并被指数富集；对最后一轮筛选后制备的文库进行克隆、测序，其中长度及两端序列与文库相符者即为核酸适配子；测定各核酸适配子与靶标结合的特异性和亲和力，选出能高特异性和高亲和力结合靶标者，即可应用于靶标的检测分析。

发明内容

本发明的目的是提供一种DNA适配子，能够特异性结合尿路上皮癌中的CXCLl蛋白，可以来实现尿路上皮癌治疗药物运送的靶向性，可用于尿路上皮癌的诊断与治疗。

本发明采用以下技术方案：

体外合成一个含有40个随机序列的单链DNA文库，通过体外转录构建出单链RNA适配子随机文库；采用CXCLl蛋白为靶蛋白，采用SELEX技术筛选具有高亲和力的表面抗原特异性RNA适配子；通过结构预测软件RNAStructureProgram分析预测适配子的二级结构；通过膜结合测定实验、凝胶阻滞实验鉴定筛选适配子对靶蛋白的特异性和亲和力，得到了多个与表面抗原亲和力高、特异性强的适配子。所述的适配子都能形成各自的特异茎环结构。所述适配子能特异性、高亲和力地结合CXCLl蛋白。所述适配子序列如下：

CXC-1：

GCTATCTAGCCTATCTGGAACACCCTCTCGCTTAACTATTACAATCTATTCATATGTTATCAGCGTAACGCAGCACTGCA

CXC-2：

GCTATCTAGCCTATCTGGAACCAATTCGCAAATTAACCTCCGCTCACACACACCGCACCTAAGCGTAACGCAGCACTGCA

本发明的有益效果：(1)获得了一种能够特异高效结合CXCL1蛋白的适配子。该适配子可以大量人工制备，方法简单，成本低廉。(2)以核酸适配子为基础可以制备成为靶向尿路上皮癌细胞的诊断和治疗药物。

具体实施方式