[发明专利]一种快速检测单增李斯特菌的方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物检测领域，具体采用Fe₃O₄/Ru(bqy)₃²⁺纳米微球集成免疫磁珠捕获技术和免疫层析快速检测单增李斯特菌。

技术背景

单核细胞增生李斯特氏菌简称单增李斯特菌，是一种人畜共患的食源性致病菌。该菌在自然界中分布广泛，并且在4℃冰箱保存的食物中仍能生长繁殖，是冷藏食品中威胁人类健康的主要病原菌之一。单增李斯特菌极易污染肉、蛋、海产品、乳制品、蔬菜等食品，引起食物中毒和李斯特菌病的发生。李斯特菌病具有妊娠期感染多、胎儿严重并发症多、免疫受损人群易发、脑膜脑炎几率高、死亡率高等特点，严重威胁人类身体健康和社会经济的发展。因此，建立有效的预警机制，做到早预防、早发现、早处理，对保障食品安全和预防李斯特菌病爆发具有重大意义。

目前检测单增李斯特菌的金标准是传统分离鉴定法，该方法需经过预增菌、选择性增菌、分离培养、生理生化鉴定及血清型鉴定等步骤，整个过程繁琐耗时(3-7天)；PCR方法、电化学方法以及生物传感器法对单增李斯特菌检测灵敏度高，然而它们需要较长的检测时间、昂贵的仪器以及专业的技术人员。因此，建立快速、简单、灵敏的检测方法对食源性致病菌的检测具有重要意义。

胶体金免疫层析试纸条以其操作简单、快速(10-15min)、准确等特点成为基层筛选的重要工具，然而由于胶体金的光学信号有限，胶体金免疫层析试纸条的灵敏度不高，对单增李斯特菌的检测限通常不高于10⁵CFU/mL，这个缺陷限制了其在食品和农产品检测中的应用。因此，提高试纸条的灵敏度将为单增李斯特菌的检测提供简单、高效的途径。

发明内容

本发明目的在于提供一种快速、灵敏、简便的单增李斯特菌定性、定量检测技术。

本发明具体方案如下：

一种快速检测单增李斯特菌的方法，包括以下步骤：

1)纳米微球的制备：

a.添加0.4-0.8mmolFeCl₃·6H₂O和0.2-1.6mmol FeCl₂·4H₂O到100mL的去离子水中，向溶液中通入氮气并加热到80-120℃，然后将3-7mL 25％的NH₃·H₂O添加到混合液中，反应2h；用永磁铁从反应溶液中分离出黑色的固体物质用高纯水清洗3～5次，得Fe₃O₄纳米粒子；

b.取12mg Fe₃O₄纳米粒子用1-10mL去离子水和20mL乙醇的混合液重悬，先在缓慢搅拌的条件下加入0.3-0.9mL的NH₄OH溶液，再将10-300uL正硅酸乙酯溶解在50uL乙醇溶液中逐滴加入，室温下反应12h，在Fe₃O₄纳米粒子表面形成一层二氧化硅，用去离子水溶液清洗几次，在乙醇溶液中复溶得到二氧化硅包覆的Fe₃O₄纳米粒子；

c.把10-300uL的正硅酸乙酯，20mL无水乙醇，1-10mL去离子水和1mL 0.5-3mg/L的啡啰啉联钌(Ru(bqy)₃²⁺)混合，将混合溶液加入0.5mL二氧化硅包覆的Fe₃O₄纳米粒子，最后加入600-900μL的NH₄OH，剧烈搅拌3h，得到Fe₃O₄/Ru(bqy)₃²⁺纳米微球，用去离子水清洗备用；

d.将1mL的巯丙基三甲氧基硅烷添加到10mL的乙醇溶液中，用该混合物复溶Fe₃O₄/Ru(bqy)₃²⁺纳米微球，在常温下300rpm搅拌12h后，再80℃ 300rpm搅拌1h，离心得到硅烷化的Fe₃O₄/Ru(bqy)₃²⁺纳米微球；