[发明专利]磁珠转化普鲁士蓝的禽流感病毒免疫生物传感器及方法

权利要求书

1.一种磁珠转化普鲁士蓝的禽流感病毒免疫生物传感器，其特征在于包括由磁珠转化而成的普鲁士蓝和三电极系统，三电极系统以饱和甘汞电极为参比电极，碳电极为对电极，伴刀豆球蛋白A修饰磁珠标记电极为工作电极；

制备获得作为参比电极的饱和甘汞电极和作为对电极的碳电极，所述伴刀豆球蛋白A修饰磁珠标记电极和普鲁士蓝具体制备过程如下：

1)处理磁珠水溶液制备获得伴刀豆球蛋白A修饰磁珠分散液；

2)由伴刀豆球蛋白A修饰磁珠分散液处理获得伴刀豆球蛋白A修饰磁珠标记电极；

3)将伴刀豆球蛋白A修饰磁珠标记电极置于铁氰化钾和硫酸钾混合溶液中，采用三电极系统，伴刀豆球蛋白A修饰磁珠标记电极为工作电极，甘汞电极为参比电极，碳棒为对电极，进行多电位阶越扫描获得普鲁士蓝。

2.根据权利要求1所述的一种磁珠转化普鲁士蓝的禽流感病毒免疫生物传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤1)具体如下：

1.1)将磁珠水溶液在工作频率为40kHz，功率为160W的超声作用下分散5min，得到分散均匀的磁珠分散液；

1.2)将用于羧基化磁珠的柠檬酸与磁珠分散液混合，静置于旋转仪上12h过夜得到羧基化磁珠分散液，柠檬酸的含量为0.1mmol-0.3mmol每毫克磁珠；

1.3)将上述羧基化磁珠分散液依次进行磁性分离、去除上清液，然后将磁珠用磷酸盐缓冲液清洗三次，然后分散于MES缓冲液中，使得磁珠的最终浓度为1mg/mL，4℃下保存；

1.4)将EDC和NHS加入到1mL上述羧基化磁珠的MES分散液中，常温下搅拌反应2小时，用磷酸缓冲液磁性分离、去除上清液，重复清洗三次，得到活化磁珠，分散在1mL磷酸缓冲液中；

1.5)取活化磁珠与伴刀豆球蛋白A于常温下反应，用磷酸缓冲液磁性分离、去除上清液，重复清洗三次，得到伴刀豆球蛋白A修饰磁珠，分散在1mL磷酸缓冲液中，在冰箱中4℃保存。

3.根据权利要求1所述的一种磁珠转化普鲁士蓝的禽流感病毒免疫生物传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤1)具体如下：

2.1)将干净的金磁电极在二硫双琥珀酰亚胺基丙酸酯的丙酮溶液中浸泡，丙酮洗3次，然后超纯水洗3次，获得二硫双琥珀酰亚胺基丙酸酯修饰金磁电极；

2.2)在二硫双琥珀酰亚胺基丙酸酯修饰金磁电极上滴加伴刀豆球蛋白A溶液，常温下反应，用PBS缓冲液清洗，获得蛋白A修饰金磁电极；

2.3)在伴刀豆球蛋白A修饰金磁电极表面滴加禽流感病毒H5N1抗体溶液，常温下反应，用PBS缓冲液清洗，获得抗体修饰金磁电极；

2.4)在抗体修饰金磁电极表面滴加牛血清白蛋白溶液，常温下反应以封闭非特异性结合位点，用PBS缓冲液清洗，最终获得传感电极；

2.5)在传感电极表面滴加禽流感病毒H5N1悬浊液，常温下培育，用PBS缓冲液清洗，获得检测电极；

2.6)取伴刀豆球蛋白A修饰磁珠分散液滴加到检测电极表面，常温反应，用PBS缓冲液清洗，获得伴刀豆球蛋白A修饰磁珠标记电极。

4.根据权利要求3所述的一种磁珠转化普鲁士蓝的禽流感病毒免疫生物传感器的制备方法，其特征在于：所述的干净的金磁电极采用以下方式清洗：金磁电极依次在砂纸、0.5μm氧化铝粉末和0.05μm氧化铝粉末中打磨，打磨后经充分清洗，再依次在超纯水、乙醇和超纯水中各超声5分钟，配制Prihna溶液滴加5μL于电极表面，保持5分钟，最后采用大量水进行清洗。

5.根据权利要求2所述的一种磁珠转化普鲁士蓝的禽流感病毒免疫生物传感器的制备方法，其特征在于：

所述步骤1.2)中柠檬酸与磁珠分散液的配比为0.1mmol-0.3mmol每毫克磁性纳米料子；所述步骤1.5)中活化磁珠与伴刀豆球蛋白A的质量比为1：5-1：10，时间为1h，反应时间为45-90min。