[发明专利]一种定量检测含糖醛酸多糖的方法

说明书

技术领域

本发明属于糖醛酸多糖检测技术领域，特别是涉及一种定量检测含糖醛酸多糖的方法。

背景技术

结构中的重复二糖是由一个糖醛酸与一个氨基己糖或己糖组成的多糖广泛存在于自然界中。如糖胺聚糖中的肝素、硫酸软骨素、透明质酸等，都是由糖醛酸与氨基己糖连接而成的重复二糖片段构成。另外，在一些贝类等生物中还发现了含有糖醛酸与己糖连接而成的重复二糖片段的多糖，如鲍鱼性腺多糖AGSP等。由于具有显著的功能活性，一些含糖醛酸多糖被开发为药品和保健品等。如硫酸软骨素能有效预防关节炎，还具有抗癌、抗HIV、降血脂、抗凝血等功效，被开发为药品、保健食品、化妆品等；肝素被开发为抗凝血药物，在临床上应用广泛；透明质酸由于强持水性等性能，应用于临床治疗、诊断、化妆品基质以及营养保健品等。另外，还有一些食物中含糖醛酸多糖被证实具有增强免疫等生物活性，是重要的功效成分。因此，定量检测这些含糖醛酸多糖是相关药品、保健品、化妆品等产品质量控制的必要措施，也是对含这类多糖的食品质量评价的有力手段。

目前，对这些含糖醛酸多糖的定量检测，化学显色法最为常用，例如通过咔唑法测定糖醛酸含量从而间接测定这些含糖醛酸多糖，而含氨基糖的肝素、硫酸软骨素、透明质酸等糖胺聚糖还可以通过Elson-Morgan法测定氨基糖含量来间接定量。但这些化学显色法缺乏特异性，对于同时含有几种这类多糖的样品，只能测出它们的总量，而无法确定每一种多糖的含量。有文献报道采用高效液相色谱-液质联用技术对糖胺聚糖酶解后产生的二糖进行定量，从而对各种糖胺聚糖进行定量，但糖胺聚糖酶的降解酶价格都十分昂贵，而含糖醛酸-己糖二糖片段多糖还没有商品化的降解酶，因此该方法难以广泛应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种定量检测含糖醛酸多糖的方法。

本发明实现上述目的的技术方案如下：一种定量检测含糖醛酸多糖的方法，包括以下步骤：

步骤1，将已知的多糖配制成系列浓度的标准多糖溶液；

步骤2，提取待测样品中的多糖并配置成待测样品溶液；

步骤3，将标准溶液和待测样品溶液中的多糖水解，得到水解残余物；

步骤4，步骤3所得残余物用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮衍生化，制备糖的衍生物；

步骤5，利用高效液相色谱仪和三重四极杆串联线性离子阱质谱仪对糖的衍生物进行分析；

步骤6，依据标准多糖混合溶液的MRM色谱图及待测样品溶液的MRM色谱图，利用色谱峰保留时间和监测离子丰度比确定待测样品为何种含糖醛酸多糖；

步骤7，根据高效液相色谱-质谱获得的标准多糖二糖衍生物的MRM色谱图，制定色谱峰面积与多糖浓度的标准曲线，利用待测样品的峰面积计算待测样品中含糖醛酸多糖的含量。

本发明如上所述的定量检测含糖醛酸多糖的方法，优选地，步骤1和步骤2中制备的标准多糖溶液、待测样品溶液中含有三氟乙酸；在步骤3的具体过程为：标准品溶液、样品溶液密封，在105℃水解3h；酸水解液使用冷冻离心浓缩除去溶剂，再加入0.5mL甲醇，使用冷冻离心浓缩除去溶剂，以上操作重复三次，达到除酸目的。

本发明如上所述的定量检测含糖醛酸多糖的方法，优选地，步骤4的具体过程为：加入300μL的氨水溶解残渣，再加入300μL 0.3mol/L的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)甲醇溶液，密封，70℃水浴30min，加入1mL甲醇，真空冷冻离心减压除去溶剂，重复三次；然后加入1mL水，再加入1mL的氯仿，震荡后除去氯仿，重复萃取三次，水层作为供试液。

本发明如上所述的定量检测含糖醛酸多糖的方法，优选地，步骤5的具体过程为：以乙腈/20mM乙酸铵水溶液为流动相，使用配备反相C18色谱柱的高效液相色谱-质谱联用分析，离子源ESI源；正离子模式，监测不同种类多糖二糖片段衍生物的特征离子对。

本发明如上所述的定量检测含糖醛酸多糖的方法，优选地，所述特征离子对如下：687.30/511.20、686.30/492.10、686.30/525.20、686.30/510.12、687.30/373.00、687.30/187.00、686.30/175.00、686.30/187.00、687.30/175.00、686.30/373.00。

本发明如上所述的定量检测含糖醛酸多糖的方法，优选地，所述含糖醛酸多糖为具有一个糖醛酸与一个氨基己糖或己糖组成的重复二糖片段的多糖。