[发明专利]一种多肽纯化制备的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种多肽纯化制备方法，具体为一种利用反相高效液相色谱法结合乙腈的回收循环利用，对多肽进行纯化制备的方法。

背景技术

随着现代生物技术的发展,出现了各种多肽类药物，多肽在临床医学中有巨大的应用价值。自从发明固相法化学合成多肽以来，有关各种活性多肽的化学合成有了很大发展，但产物成分比较复杂，一般是以目标多肽为主的几种结构相似的多肽混合物。因此，对这一混合物的分离纯化一直是一个重要的研究课题，对其分离纯化的最优化研究就显得格外重要。此外，提供高纯度的多肽样品，对于其物化性质、生物活性及其医药功能的研究具有重要的作用。从现代分离科学理论得出，色谱和电泳是目前所知的分离效果最佳的两种方法。电泳仅能用于分离而不能用于多肽的分离纯化。而高效液相色谱经过30多年的快速发展，在色谱理论研究、仪器研究水平、分析实践应用、质量研究、工业化大生产等方面，已经取得了长足的进步。其中反相高效液相色谱因其良好的选择性，具有分离效果好、分辨率高、回收率高的特点，在多肽的分离纯化中备受青睐，其应用范围不断扩大，具有广阔前景。

利用反相高效液相色谱对多肽进行分离纯化时，反向色谱柱填料常是以硅胶为基质，表面键合有极性相对较弱官能团的键合相，通常使用十八烷基硅烷键合硅胶。反向色谱所使用的流动相极性较强，通常以水、缓冲液为水相，甲醇、乙腈、异丙醇等为有机相，水相和有机相组成混合试剂进行二元梯度洗脱。样品流出色谱柱的顺序是极性较强的组分最先被冲洗出，而极性弱的组分会在色谱柱上有更强的保留。

近年来，乙腈成为反相高效液相色谱常用的有机改性剂和溶剂，特别是在多肽分离纯化领域应用非常广泛。反相高效液相色谱对多肽进行分离纯化时，所使用的流动相（乙腈和水相）中，乙腈所占的比例为30%-70%（V/V），这样大量的乙腈使用后不加以回收利用，非常可惜，不仅会造成资源的浪费，还会污染环境。

随着雾霾天频现，人们对大气污染越来越关注。挥发性有机物作为四大总体污染物之一，是形成霾和PM2.5的前提物，是造成环境污染、损害人体健康的主要“元凶”，因此，国家对挥发性有机物的治理势在必行。挥发性有机污染物早在上世纪八十年代，美国等发达国家就已经开始重视挥发性有机污染物的减排问题。2010年5月国务院发布《关于推进大气污染联防联控工作改善区域空气质量的指导意见》，首次将挥发性有机物与二氧化硫、氮氧化物、颗粒物等一起列为大气污染联防联控的重点污染物，提出加大挥发性有机物污染防治。“十二五”期间，挥发性有机物污染治理和防控政策则进入密集发布期，环保“十二五”规划提出要开展挥发性有机物和有毒废气监测，完善重点行业污染物排放标准。目前，挥发性有机物治理已进入我国大气污染治理日程。2015年上半年，环保部印发了《挥发性有机物排污收费试点办法》，2015年12月17日，上海市发布《上海市挥发性有机物排污收费试点实施办法》，决定试点收取挥发性有机物排污收费。试点分三个阶段实施，逐步提高收费标准。针对这种情况，许多企业为了减少有机物排污，将产生的挥发性有机物，如乙腈废液等，进行回收后，对其进行精制，然后重新供给生产企业使用。

传统的乙腈回收有变压精馏法、恒沸精馏法、盐析方法、脱水剂脱水法，这几种方法均使用粗蒸及精馏两个步骤，使用特殊的精馏方法进行分离处理，存在处理方法复杂、设备成本高以及分离效率低，能耗高等问题。

传统的转盐方法是利用玻璃柱或者聚乙烯柱里面装填阴阳离子树脂，利用离子交换的原理实现多肽产品的转盐过程。另外利用传统阴阳离子交换原理，对多肽产品进行转盐，步骤1）在调整多肽产品液体的PH后，上样挂柱2）冲洗样品3）利用酸碱调整冲洗液的PH后将多肽产品冲洗下来，在此过程中，每一个环节都要取少许的流出液进行HPLC检测，确认冲洗干净后，方可进行下一步工作。所以此方法，工作流程多，时间消耗大，而且会产生大量的废液，更重要的是最后收集的多肽产品合格液体积大，不利于下面的浓缩和冻干工作。另外需要购置仪器设备和阴阳离子填料，还需另外安排实验场地和人员，耗费了大量的人力物力。

国内外不乏关于反相高效液相色谱应用的文献，也有许多关于乙腈回收、精制的文献资料，但是少有利用反相高效液相色谱法结合乙腈的回收循环利用，对多肽进行分离纯化的方法相关文献。

发明内容