[发明专利]来源于人尿液细胞的外泌体的获取方法与应用

说明书

一种人尿液来源细胞的外泌体的获取方法，是首先分离培养人尿液来源细胞并收集培养基，将人尿液来源细胞的培养基通过0.22微米滤膜过滤，以去除大的细胞残片以及其它杂质；然后离心除去细胞器，留取上清；再使用可截留100KD分子量的膜，通过离心截留上清中的外泌体，截留完成后，使用PBS对膜进行洗脱即得到外泌体浓缩液。本发明的外泌体可用于制备具有抗凋亡、促进血管新生、修复缺血损伤、促进细胞生长的药物，以及用于治疗皮肤缺损、皮肤溃疡、褥疮、骨缺损、骨不连、股骨头坏死、肾损伤、缺血性损伤、脊髓损伤、胰岛损伤、糖尿病及其并发症、阿尔茨海默氏症等。

技术领域

本发明涉及生物医学，尤其涉及一种来源于人尿液细胞的外泌体的获取方法与应用。

背景技术

近年的研究显示细胞移植治疗在修复各种组织器官损伤方面具有显著的效果和广阔的应用前景。但是，直接移植细胞用于人体疾病治疗还存在安全性、免疫排斥、成瘤隐患以及运输储存困难等诸多问题。近年的研究提示细胞发挥其修复组织损伤功能主要是通过旁分泌机制实现的，而旁分泌机制中细胞分泌的外泌体可能是细胞发挥功能的关键组分。

外泌体为真核细胞的多泡体和胞膜融合后分泌到胞外的双层膜包裹的结构，它含有类似其来源细胞的胞膜成分、蛋白质及各种RNA组分，通过与细胞膜发生融合或者以靶受体的方式结合，在细胞与细胞之间传递细胞因子、蛋白质或者RNA等一系列生物活性物质，从而使靶细胞发生一系列生物学效应。最近的研究证实，人体多种细胞可分泌外泌体，人体体液中(血液、尿液、唾液、乳液)都含有外泌体，体外培养细胞的条件培养液中都存在由细胞分泌的外泌体；高效液相色谱分析证实不同细胞分泌的外泌体含有不同或不同剂量的蛋白质；芯片检测技术分析证实不同细胞分泌的外泌体含有不同或不同剂量的信使RNA和小RNA。因此，不同细胞来源的外泌体所发挥的生物学功能是不相同的，各有其独特性。

从尿液中分离培养细胞，具有来源方便、可以大量获取、取材无创等优势。目前通过培养尿液来源细胞获得其外泌体并用于修复组织损伤及治疗疾病的方法尚未见报道。

发明内容

本发明的目的，就是为了提供一种来源于人尿液细胞的外泌体的获取方法与应用。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：一种来源于人尿液细胞的外泌体的获取方法，首先分离培养人尿液来源细胞并收集培养基，将人尿液来源细胞的培养基通过0.22微米滤膜过滤，以去除大的细胞残片以及其它杂质；然后离心除去细胞器，留取上清；再使用可截留100KD分子量的膜，通过离心截留上清中的外泌体，截留完成后，使用PBS对膜进行洗脱即得到外泌体浓缩液。

将外泌体浓缩液转移至蔗糖/重水密度垫上离心分离，收集底部蔗糖/重水密度垫，加入两倍体积PBS，转移至可截留100KD分子的超滤细心管中离心分离；PBS洗涤3次，得到纯化的外泌体悬液。

所述离心除去细胞器是4℃、10000g离心30分钟。

所述离心截留上清中的外泌体是3500g离心15分钟。

所述蔗糖/重水密度垫的密度为1.210g/cm³，其中的蔗糖的重量百分含量为30％；所述转移至蔗糖/重水密度垫上离心分离是4℃、100800g离心210分钟；所述转移至可截留100KD分子的超滤细心管中离心分离是4℃、3500g离心15分钟。

所述人尿液来源细胞包括直接从尿液中分离的细胞；从尿液中分离并在体外培养的细胞；从尿液中分离并在体外培养且经过基因改造或药物处理的细胞；以及通过药物刺激引发泌尿系统细胞激活、游离至尿液中而获得的细胞。

所述外泌体的标志物为CD9、CD11b、CD54、CD63、CD81、CD82以及与人尿液来源细胞特性相应的标志物。

所述与人尿液来源细胞特性相应的标志物包括CD146、CD34、CD24、CD133、SIX2、PAX2、WT1、LHX1或OSR1。