[发明专利]一种抑菌活性增强的猪链球菌噬菌体裂解酶及其制备方法

说明书

本发明属于生物技术领域，涉及一种抑菌活性增强的猪链球菌噬菌体裂解酶及其制备方法；本发明是以lySMP编码区基因序列为模板，通过易错PCR对其进行随机突变，然后将PCR产物与pET‑28a(+)连接，在BL21中诱导表达，通过96孔板筛选的方法获得比LySMP活性提高1.8倍的裂解酶elysin；并通过96孔板测定了其最适pH和最适温度；由于裂解酶具有作用迅速、不易产生抗性、与其他抗生素有协同杀菌作用的特点，现已成为一种有潜力的杀菌制剂；利用本发明中所获得裂解酶elysin可以进一步研究裂解酶作为一种有效的杀菌制剂在对抗猪链球菌感染中的作用，以期在猪链球菌的防控方面作出贡献。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种抑菌活性增强的猪链球菌噬菌体裂解酶

及其制备方法，具体的说是猪链球菌噬菌体裂解酶elysin的制备方法，特别是该裂解酶对猪链球菌SS2-4的抑菌活性是LySMP抑菌活性的1.8倍。

背景技术

猪链球菌病是由多种猪源链球菌(Streptococcus suis)引起的是一种疾病，其中，猪链球菌血清2型的感染能导致仔猪脑膜炎、败血症、关节炎、心内膜炎、肺炎和人的脑膜炎，对公共卫生尤其是相应从业人员的生命安全构成严重威胁。现阶段，对于猪链球菌病的治疗，有效的方法是使用抗生素。但抗生素的滥用能导致猪链球菌病的耐药性问题；应用噬菌体裂解酶（lysin）治疗细菌病是目前解决细菌耐药性的一种有效的方法（噬菌体裂解酶-一种新型的革兰氏阳性菌抗菌物.；Fischetti VA. Bacteriophage endolysins: anovel anti-infective to control Gram-positive pathogens [J]. InternationalJournal of Medical Microbiology. 2010, 300(6): 357-62.）。

裂解酶是噬菌体病毒复制晚期合成的一类细胞壁水解酶，又称内溶素、溶胞壁酶，可以水解宿主菌的肽聚糖结构。它位于穴蛋白（holin）的下游，与穴蛋白一起形成了双链DNA噬菌体的穴蛋白-裂解酶裂解系统，可以破坏细菌细胞壁结构，从而导致宿主菌破裂。

本发明的前期工作已经通过原核表达的方式获得了裂解酶LySMP，并证明该酶具有裂解猪链球菌的活性（纯化的噬菌体裂解酶LySMP：一种能够扩大猪链球菌的裂解谱的酶；Wang Y, Sun JH, Lu CP. Purified recombinant phage lysin LySMP: anextensive spectrum of lytic activity for Swine Streptococci[J]. CurrentMicrobiology. 2009, 58:609-615.）。在此基础上，本发明通过易错PCR的方法对LySMP的基因序列进行随机突变，通过96孔板筛选活性增强的突变株。

经过对现有文献分析，利用易错PCR的方法对LySMP的编码基因进行随机突变，突变产物经原核表达获得了增强的裂解活性，利用该酶和该流程筛选猪链球菌噬菌体裂解酶在国内未见报道。

发明内容

本发明的目的在于对原有的LySMP裂解酶通过易错PCR的方法进行随机突变后，再导入大肠杆菌BL21中进行表达，以期获得对猪链球菌SS2-4裂解活性增高的裂解酶，筛选了一株裂解活性增强的裂解酶elysin。

本发明是通过以下技术方案实现的：

（1）易错PCR扩增裂解酶基因，使之产生随机突变：以LySMP编码区基因序列为模板，通过易错PCR对其进行随机突变；

（2） 将步骤（1）获得的PCR产物通过酶切回收插入载体pET-28a(+) 中，获得重组质粒；

（3）步骤（2）将所获得的重组质粒导入大肠杆菌BL21中进行表达获得一个裂解酶基因的突变表达文库，通过96孔板筛选具裂解活性的裂解酶并进行纯化；