[发明专利]一种基于免疫过氧化物酶细胞单层试验的GCRV病毒Ⅱ型抗体检测试剂盒及其方法

权利要求书

1.一种基于免疫过氧化物酶细胞单层试验的草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型抗体检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒含有细胞内阳性抗原。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述细胞内阳性抗原固定在细胞培养板上。

3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述细胞内阳性抗原为感染了Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒的细胞。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述细胞为草鱼鳔细胞系GSB。

5.根据权利要求2或4任一所述的试剂盒，其特征在于：所述细胞内阳性抗原固定在细胞培养板上的具体操作为：将Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒接种到新消化的GSB细胞悬液中，混匀，加入到细胞板中，于27.5℃~28.5℃条件下培养至形成单层细胞后取出，弃去细胞培养液，用PBS清洗后，用固定液固定12～17min，干燥后即可。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：该试剂盒还含有抗草鱼IgM单克隆抗体，HRP标记的羊抗鼠单克隆抗体IgG。

7.根据权利要求1或6所述的试剂盒，其特征在于：该试剂盒还含有细胞内阴性抗原，阳性对照血清，阴性对照血清，样品稀释液，磷酸盐缓冲液洗涤液，AEC显色液和血清稀释板。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述细胞内阴性抗原为未感染草鱼呼肠孤病毒的细胞，固定在细胞板中；

所述阳性对照血清为经草鱼呼肠孤病毒疫苗株892株病毒免疫后的血清，ELISA抗体效价在1:400以上；

所述阴性对照血清为未经草鱼呼肠孤病毒免疫的血清；

所述样品稀释液由25mMDTT、100mMpH8.0的Tris缓冲液、2mMpH8.0的EDTA和200mMNaCl组成。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于：所述细胞为草鱼脑细胞系GSB。

10.一种基于免疫过氧化物酶细胞单层试验的草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型抗体检测方法，其特征在于：包括如下步骤：

1）将固定有细胞内阳性抗原和细胞内阴性抗原的细胞板，于室温预热25～35min，PBS洗1～2次；

2）加入一抗：用PBS将待检血清进行系列稀释后，分别加入固定有细胞内阳性抗原或细胞内阴性抗原的细胞板孔中，每孔80～130μL；另外加入阳性对照血清、阴性对照血清分别作为阳性对照和阴性对照；

3）温育和洗涤：36.5~37.5℃湿盒孵育45~75min，PBS洗涤；

4）加入二抗：加入稀释如的抗草鱼IgM单克隆抗体，每孔80～130μL；

5）温育和洗涤：同步骤3）；

6）显色：加入底物ACE，每孔80～120μL，室温显色15～45min；

7）去除底物液后，每孔加入PBS，用光学显微镜观察，判定结果。