[发明专利]一种利用赤霉菌合成11α;15α-diOH-沃氏氧化物的方法

说明书

本发明属生物技术领域，具体涉及利用赤霉菌(Gibberella intermedia)CA3‑1转化底物沃氏氧化物为11α,15α‑diOH‑沃氏氧化物的方法。该菌株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.4903。赤霉菌(Gibberella intermedia)CA3‑1能转化沃氏氧化物为11α,15α‑diOH‑沃氏氧化物，在底物投料浓度为4g/L时，沃氏氧化物转化率高达90％，11α,15α‑diOH‑沃氏氧化物的得率为68.76％。11α,15α‑diOH‑沃氏氧化物的合成为甾体药物及其中间体的研究提供了更多元化的前体，具有一定的研究价值和市场意义。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及利用一株赤霉菌(Gibberella intermedia)CA3-1转化底物沃氏氧化物为11α,15α-diOH-沃氏氧化物的方法。

背景技术

沃氏氧化物也叫16,17α-环氧-4-孕甾烯-3,20-二酮，16,17α-环氧黄体酮或环氧孕酮，是合成甾体皮质激素与甾体孕激素药物的重要中间体，可以用来合成氢化可的松，乙酸孕酮，醋酸可的松，倍他米松，氯地孕酮，甲地孕酮等。同时，沃氏氧化物也是一种孕激素，在体内对雌激素激发过的子宫内膜有显著的形态学影响，是维持妊娠所需要的物质。其在生物体内能被氧化多种羟基化产物，其中关于11α-OH-沃氏氧化物的报道较多，11α-OH-沃氏氧化物可用于合成氢化可的松这类皮质激素甾体药物。而目前对其11α、15α双羟基产物未有报道。与传统的化学合成方法相比，通过微生物作用以生物转化的方法具有反应步骤少、条件温和、规模生产，以及不污染环境等众多优势。利用微生物转化技术，可选择性的在沃氏氧化物的母核中引入一个或多个羟基位点，从而合成多种甾体药物的中间体，用于生产多种抗炎药物。由于甾体化合物独特的生物活性和药用价值，国家已把甾体激素药物新资源开发作为医药行业近期技术发展的方向和重点之一。

近些年来，科研工作者已经找到了多株对沃氏氧化物具有转化能力的菌株，如新月弯孢酶(Curvularia lunata)、蓝色犁头霉菌(Absidia coerulea)、黑根霉(Rhizopusnigricans)及雅致小克银汉霉(Cunninghamella elegans)等。其均能高效转化沃氏氧化物为11α-OH-沃氏氧化物，而未见转化生成11α,15α-diOH-沃氏氧化物的报道，本发明发现利用赤霉菌(Gibberella intermedia)CA3-1可以转化沃氏氧化物为11α,15α-diOH-沃氏氧化物。11α,15α-diOH-沃氏氧化物的合成为甾体药物及其中间体的研究提供了更多元化的前体，而且C11α、15α双羟化反应作为一种新的甾体羟化反应类型，为甾体药物合成开辟了新的途径，具有一定的研究价值和市场意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新型的沃氏氧化物双羟基化产物(11α,15α-diOH-沃氏氧化物)以及其转化合成方法。通过两步转化法，利用赤霉菌(Gibberella intermedia)CA3-1转化底物沃氏氧化物为11α,15α-diOH-沃氏氧化物。该菌保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.4903，保藏日期为2011年5月24日，分类命名为Gibberella intermedia。

采用上述微生物转化沃氏氧化物为11α,15α-diOH-沃氏氧化物的方法，其具体步骤如下：

(1)以赤霉菌CA3-1为生产菌株，25～35℃，150～220r/min条件下活化培养得到种子液，然后将种子液稀释涂布到PDA平板上；

(2)制备CA3-1菌株的细胞液体培养物：挑取步骤(1)的PDA固体培养基上的CA3-1菌株一环，接种于已灭菌的装有50～100mL种子培养基的500mL锥形瓶中，培养温度为25～35℃，置摇床上以180～220r/min的转速培养12～20h至对数生长中后期，即得到CA3-1菌株的种子培养液；