[发明专利]一种从发酵液中分离提取四氢嘧啶的方法

权利要求书

1.一种从发酵液中分离提取四氢嘧啶的方法，包括如下步骤：

a、取富含四氢嘧啶的发酵液，用盐酸调节pH为3.0-6.0后泵入微滤膜分离系统，收集过滤液，当过滤液中四氢嘧啶浓度低于1.0g/L时停止收集，得到除去菌体的四氢嘧啶微滤液；

b、将a步获得的微滤液泵入超滤膜分离系统，对微滤液进行除蛋白和脱色处理，收集过滤液，当过滤液中四氢嘧啶浓度低于1.0g/L时停止收集，得到除去蛋白和色素的四氢嘧啶超滤液；

c、将b步获得的超滤液泵入离子交换柱，经阳离子交换树脂吸附，进样流速为1BV/h，吸附饱和后采用0.02-0.2mol/L的氨水洗脱，洗脱流速为0.05-2BV/h，收集pH=7-12的四氢嘧啶高流分洗脱液；

d、将c步获得的高流分洗脱液加入0.05%-5% m/v 的活性炭脱色，温度20-40℃，搅拌脱色10-30 min，过滤获得四氢嘧啶脱色液；

e、将d步获得的脱色液减压浓缩至原体积的5%-15%，加入乙醇沉淀获得四氢嘧啶粗品；

f、将e步获得的四氢嘧啶粗品重新溶解于去离子水至饱和，4℃下静置结晶后过滤获得晶体，60℃干燥后得到四氢嘧啶成品。

2.如权利要求1所述的一种从发酵液中分离提取四氢嘧啶的方法，其特征在于，步骤a中所述的微滤膜分离系统采用中空纤维微滤膜，微滤膜孔径为0.02-0.2μm，操作温度为25-45℃，操作压力为0.05-0.2MPa。

3.如权利要求1所述的一种从发酵液中分离提取四氢嘧啶的方法，其特征在于，步骤b中所述的超滤膜分离系统采用中空纤维超滤膜，超滤膜孔径为0.001-0.01μm，操作温度为25-45℃，操作压力为0.1-0.5MPa。

4.如权利要求1所述的一种从发酵液中分离提取四氢嘧啶的方法，其特征在于，步骤c中所述的阳离子交换树脂为凝胶型树脂或大孔型树脂。

5.如权利要求1或4所述的一种从发酵液中分离提取四氢嘧啶的方法，其特征在于，步骤c中所述的阳离子交换树脂为001*7，D072，D061树脂中的一种。

6.如权利要求1所述的一种从发酵液中分离提取四氢嘧啶的方法，其特征在于，还包括对步骤f得到的四氢嘧啶成品纯度的检测，使用 UltiMate 3000 Thermo Scientific高效液相色谱仪测定四氢嘧啶，色谱柱为 TSK-GEL C18 色谱柱，柱温 30℃，流动相为2%乙腈，流速 1mL/min，紫外检测波长 210nm。

7.如权利要求1所述的一种从发酵液中分离提取四氢嘧啶的方法，包括如下步骤：

a、取四氢嘧啶发酵液5L，四氢嘧啶含量25.0g/L，用4mol/L的盐酸调节pH为4.0，进入微滤膜分离系统，得到去除菌体的四氢嘧啶微滤液；所述微滤膜分离系统采用中空纤维微滤膜，微滤膜孔径为0.02μm，操作温度为30℃，操作压力为0.2MPa，收集过滤液，当过滤液中四氢嘧啶浓度低于1.0g/L时停止收集；菌体去除率为99.2%；

b、将经a步得到的微滤液泵入超滤膜分离系统，得到去除蛋白和色素的四氢嘧啶超滤液；所述超滤膜分离系统采用中空纤维超滤膜，超滤膜孔径为0.003μm，操作温度为40℃，操作压力为0.3MPa，收集过滤液，当过滤液中四氢嘧啶浓度低于1.0g/L时停止收集，蛋白去除率为80.8%，透光率为72.3%；

c、将b步获得的超滤液以1BV/h的流速泵入D061阳离子交换树脂吸附，吸附饱和后用0.15mol/L的氨水洗脱，洗脱流速为0.05BV/h，收集pH为7-12的四氢嘧啶高流分洗脱液；

d、将c步获得高流分洗脱液加入3% m/v的活性炭脱色，温度40℃，搅拌脱色15min，过滤获得四氢嘧啶脱色液，透光率为99.8%；

e、将d步获得的脱色液减压浓缩至原体积液的10%，加入乙醇沉淀获得四氢嘧啶粗品；

f、将e步获得的四氢嘧啶粗品重新溶解于去离子水至饱和，4℃下静置结晶后过滤获得晶体，60℃干燥后得到四氢嘧啶成品101.3g；

g、使用 UltiMate 3000 Thermo Scientific 高效液相色谱仪测定四氢嘧啶，取f步获得的成品加水溶解后使用微量进样针，进样量20μL，色谱柱为 TSK-GEL C18 色谱柱，柱温30℃，流动相为2%乙腈，流速 1mL/min，紫外检测波长 210nm，根据标准曲线计算四氢嘧啶纯度为98.2%。