[发明专利]一种可共同用于检测结晶紫和孔雀石绿的半抗原、人工抗原的制备方法及其应用

权利要求书

1.一种可共同用于检测结晶紫和孔雀石绿的半抗原，其特征在于，所述半抗原的结构通式如下：

其中n是1或3或5。

2.一种可共同用于检测结晶紫和孔雀石绿的半抗原的制作方法，其特征在于：

包括如下步骤：

(a)：将4-甲胺基苯甲醛与通式(Ⅰ)所示化合物在无水乙醇和缚酸剂的条件下进行取代反应获得通式(Ⅱ)所示化合物，

通式(Ⅰ)为：

通式(Ⅱ)为：

(b)：将通式(Ⅱ)所示化合物溶解于无水乙醇中，加入N，N—二甲基苯胺和氯化锌，进行缩合反应，获得通式(Ⅲ)所示化合物，

通式(Ⅲ)为：

(c)：将通式(Ⅲ)所示化合物溶解于无水乙醇中，加强碱溶液至pH 值为10-11，反应获得通式(Ⅳ)所示的半抗原，

通式(Ⅳ)为：

其中，通式(I)中n是1或3或5，通式(Ⅱ)、通式(Ⅲ)、通式(Ⅳ)中的n取值与通式(Ⅰ)一致，通式(I)中R为Cl，Br或I中的任意一种。

3.根据权利要求2所述的一种可共同用于检测结晶紫和孔雀石绿的半抗原的制作方法，其特征在于：

按下面比例和步骤制作：

(a)把4-甲胺基苯甲醛和通式(Ⅰ)所示化合物以摩尔比为1：1～1.5的量溶于无水乙醇中，加入K₂CO₃，K₂CO₃与4-甲胺基苯甲醛的摩尔比为0.5～1：1，然后80～90℃回流2～5h，反应完毕，减压去溶剂，加入纯化水，再用乙酸乙酯萃取，减压去溶剂，石油醚结晶，得到通式(Ⅱ)所示化合物，

(b)将通式(Ⅱ)所示化合物溶于无水乙醇中，加入N,N—二甲基苯胺和氯化锌，上述两者的用量均为通式(Ⅱ)所示化合物摩尔量的2.5倍当量，80～90℃回流15～26h，反应完毕，减压去溶剂，加入纯化水，用乙酸乙酯萃取，再减压去溶剂，柱层析纯化，得到通式(Ⅲ)所示化合物，

(c)将通式(Ⅲ)所示化合物溶于无水乙醇中，加入6mol/L的氢氧化锂溶液至pH 值为10-11，室温反应15～26h，加入纯化水，用1M的稀盐酸调pH 值至4～5，加入乙酸乙酯萃取2次；合并有机相，减压去溶剂得产物通式(Ⅳ)所示的半抗原，

4.一种可共同用于检测结晶紫和孔雀石绿的人工抗原，其特征在于，是将权利要求1所示通式(Ⅳ)所示化合物和载体蛋白偶联得到的偶联物，其通式为：

其中n是1或3或5。

5.一种如权利要求4所述的可共同用于检测结晶紫和孔雀石绿的人工抗原的制备方法，其特征在于：

按以下比例进行操作：

(1)取权利要求1通式(Ⅳ)所示的半抗原，溶解于二甲基甲酰胺中，搅拌充分后，加入碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，半抗原、碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺的重量比为5：4：3，室温下搅拌4-8h，即可得到半抗原活化酯；通式(Ⅳ)为：

其中n是1或3或5；

(2)称取载体蛋白，载体蛋白与半抗原的重量比为3：1，使其充分溶解在0.01mol/L的PBS中，在搅拌下将半抗原活化酯反应液逐滴缓慢滴加至载蛋白溶液中，并在室温下搅拌16-24h；

(3)用0.01mol/L的PBS室温透析3天，每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质；

(4)分装，于4℃保存备用。

6.根据权利要求5所述一种可共同用于检测结晶紫和孔雀石绿的人工抗原的制备方法，其特征在于：

常用载体蛋白可采用牛血清白蛋白，卵清蛋白，人血清白蛋白和血蓝蛋白中的任意一种。