[发明专利]一种提取古代生物骨骼DNA的裂解液及方法

说明书

本发明公开了一种提取古代生物骨骼DNA的裂解液及方法。所述裂解液配方：pH8.5Tris‑HCl，10mM；EDTA，10‑15mM；SDS，1.0‑1.5wt％；NaCl，150mM；蛋白酶K，0.3‑0.5mg/ml。通过将SDS、EDTA和蛋白酶K的组分分别提高，可明显提高新裂解液对骨组织的裂解程度。同时在使用时再利用去蛋白液，DNA漂洗液处理，以及DNA离心柱法可明显减少DNA样品中的杂质成分，有利于提高PCR的扩增效果，从而有助于获取高纯度古代生物骨骼的DNA。

技术领域

本发明属于生物DNA提取技术领域，具体涉及一种提取古代生物骨骼DNA的裂解液及方法。

背景技术

从古代生物骨骼中提取DNA对于探索古代生物的生命奥秘以及人类文明的发展具有重要意义。骨骼是一种比较特殊的生物检测材料，因为外部有坚硬的保护组织，所以相对于生物体的其他组织脏器器官的降解比较慢。因此，对于高度腐化的样本来说，骨骼是进行DNA检测的有效检测材料之一。由于受周围环境中核酸酶和微生物的作用，古代生物骨骼中的DNA链会发生断裂、缺失甚至降解，不易获得足够的DNA样本。因此，目前尚需寻找一种更有效的DNA提取方法，为最大程度地提取和保存陈旧骨骼中的DNA。

由于骨骼组织异常坚固，提取DNA较其他软组织困难。而现有的一些旧方法存在组织裂解不完全，DNA丢失较多，同时获取的样本含杂质太多，苯酚/氯仿法对人体毒性大，即便脱钙法也存在占用时间太长等缺点。本发明提供了一种新的骨组织DNA提取液，无需脱钙处理和利用苯酚/氯仿，通过提高旧方法裂解液中SDS、EDTA和蛋白酶K的组分，增强裂解液对骨组织的裂解程度，使骨组织裂解更充分。骨骼裂解离心后，再将上清液利用异丙醇、去蛋白液，DNA漂洗液等处理，借助离心柱可更大程度地获取高纯度古代生物骨骼的DNA。

发明内容

本发明的目的是提供一种提取古代生物骨骼DNA的裂解液及方法。该裂解液及配套使用的方法能够使得组织裂解完全，获取的样本杂质少，更大程度地获取高纯度古代生物骨骼的DNA，而且使用环境无毒、操作简便，时间短、效率高。

一种提取古代生物骨骼DNA的裂解液，所述裂解液配方是在去离子水中溶解：pH8.5Tris-HCl，10mM；EDTA，10-15mM；SDS，1.0-1.5wt％；NaCl，150mM；蛋白酶K，0.3-0.5mg/ml。

所述裂解液优选配方是在去离子水中溶解：pH8.5Tris-HCl，10mM；EDTA，15mM；SDS，1.5wt％；NaCl，150mM；蛋白酶K，0.5mg/ml。

利用所述的裂解液提取古代生物骨骼DNA的方法，包括以下步骤：

1)剪取一小块出土的古代人骨骼，将其碾碎，称取0.3-0.4g放入1.5ml的EP管中；

2)加入250-300μl的裂解液，55-57℃孵育12–16h；

3)12000rpm离心10-15min，取200-250μl上清液入新EP管，按照体积比1:1加入250μl异丙醇，轻轻混匀后4℃静置至少10min；

4)轻轻吹打混合液，并将混合液转移至离心柱，12000rpm离心1-2min，弃收集管内的液体；

5)加入500μl去蛋白液，12000rpm离心1min，弃收集管内废液；

6)加入600μl的漂洗液，12000rpm离心1min，弃收集管内废液，并重复一次操作，本步骤操作前，须预先在漂洗液中加入3倍体积的无水乙醇；

7)打开盖子，24-26℃至少风干10–15min；

8)加入75℃预热的去离子水30-50μl洗脱DNA；

9)将收集的DNA液加入离心柱内，相同条件下再次洗脱。