[发明专利]一种提取古代生物骨骼DNA的裂解液及方法有效
| 申请号： | 201610014145.6 | 申请日： | 2016-01-08 |
| 公开（公告）号： | CN105420229B | 公开（公告）日： | 2018-07-17 |
| 发明（设计）人： | 李志远;马文波;邓思浩;李彩月;陈旦;刘亮 | 申请（专利权）人： | 中南大学 |
| 主分类号： | C12N15/10 | 分类号： | C12N15/10 |
| 代理公司： | 长沙市融智专利事务所 43114 | 代理人： | 袁靖 |
| 地址： | 410083 湖南*** | 国省代码： | 湖南;43 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 裂解液 骨骼 蛋白酶K 扩增效果 去蛋白液 高纯度 离心柱 漂洗液 再利用 对骨 裂解 配方 | ||
1.一种提取古代生物骨骼DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)剪取一小块出土的古代人骨骼，将其碾碎，称取0.3-0.4g放入1.5ml的EP管中；
2)加入250-300μl的裂解液，55-57℃孵育12–16h；
3)12000rpm离心10-15min，取200-250μl上清液入新EP管，按照体积比1:1加入250μl异丙醇，轻轻混匀后4℃静置至少10min；
4)轻轻吹打混合液，并将混合液转移至离心柱，12000rpm离心1-2min，弃收集管内的液体；
5)加入500μl去蛋白液，12000rpm离心1min，弃收集管内废液；
6)加入600μl的漂洗液，12000rpm离心1min，弃收集管内废液，并重复一次操作，本步骤操作前，须预先在漂洗液中加入3倍体积的无水乙醇；
7)打开盖子，24-26℃至少风干10–15min；
8)加入75℃预热的去离子水30-50μl洗脱DNA；
9)将收集的DNA液加入离心柱内，相同条件下再次洗脱；
所述裂解液配方是在去离子水中溶解：pH8.5Tris-HCl，10mM；EDTA，10-15mM；SDS，1.0-1.5wt％；NaCl，150mM；蛋白酶K，0.3-0.5mg/ml。
2.根据权利要求1所述的提取古代生物骨骼DNA的方法，其特征在于，所述裂解液配方是在去离子水中溶解：pH8.5Tris-HCl，10mM；EDTA，15mM；SDS，1.5wt％；NaCl，150mM；蛋白酶K，0.5mg/ml。
3.根据权利要求1所述的提取古代生物骨骼DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)剪取一小块出土的古代人骨骼，将其碾碎，称取0.3g放入1.5ml的EP管中；
2)加入300μl的裂解液，55℃孵育12–16h；
3)12000rpm离心10min，取250μl上清液入新EP管，按照体积比1:1加入250μl异丙醇，轻轻混匀后4℃静置至少10min；
4)轻轻吹打混合液，并将混合液转移至离心柱，12000rpm离心1min，弃收集管内的液体；
5)加入500μl去蛋白液，12000rpm离心1min，弃收集管内废液；
6)加入600μl的漂洗液，12000rpm离心1min，弃收集管内废液，并重复一次操作，本步骤操作前，须预先在漂洗液中加入3倍体积的无水乙醇；
7)打开盖子，25℃至少风干10–15min；
8)加入75℃预热的去离子水50μl洗脱DNA；
9)将收集的DNA液加入离心柱内，相同条件下再次洗脱。
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