[发明专利]一种濒危羊踯躅离体组织培养繁殖与保存的方法

说明书

本发明公开了一种濒危羊踯躅离体组织培养繁殖与保存的方法，建立了羊踯躅组织培养过程中最佳快速繁殖体系和保存体系，包括最适宜的外植体的选择方法，高效的多重灭菌方法，羊踯躅离体生长繁殖与保存的最适宜培养基组份以及不定芽生根、驯化移栽条件的控制等关键技术问题，最终实现羊踯躅在短时间内大量、快速、高质量的繁殖。本发明可使羊踯躅试管苗的分化率达到达100％，不定芽增殖系数月增殖倍数达8‑10.5，40d后生根率和驯化成活率均在85％以上。这可以有效地满足人们对羊踯躅日益增长的需求，进而减少人们对野生羊踯躅的破坏，有利于濒危野生羊踯躅的保护，具有巨大的科研价值、经济价值和生态价值。

技术领域

本发明属于植物生物技术与细胞工程技术领域，涉及一种濒危羊踯躅离体组织培养繁殖与保存的方法。

背景技术

羊踯躅(RhododendronmolleG.Don)，又名闹羊花和八厘麻等，是中国羊踯躅亚属中仅有的一个原生种，春季开花，花鲜黄色，可用于观赏，是杜鹃花色品种改良的重要资源。此外，羊踯躅全株器官均含有多种活性成分，花、根、果实等均可供药用，其提取物可治疗类风湿、温疟、慢性肾小球肾炎和高血压等，在医药工业上作为麻醉剂、镇痛剂，在农业上用作杀虫剂，对血吸虫和多种害虫均具有非常好的灭杀效果。

上世纪80年代以前，羊踯躅遍及华中、华南，西南地区也有少量分布。野生的羊踯躅主要是通过种子繁殖、扦插繁殖等方式。但由于羊踯躅对生境要求苛刻，细小的种子在自然条件下发芽困难，而且对其人工扦插或分株繁殖也很难成活，加上人们的滥挖乱采及生境的破坏，羊踯躅的生殖环节受到严重影响，羊踯躅野外分布的地区和种群数量急剧减少，栖息地已呈“岛屿化”，有些省份野外已难见其踪影，野生的羊踯躅早已无法满足人们对其的需要，羊踯躅濒于灭绝的风险日益加剧，亟待采取有效的方法加以保护和繁殖，使之能够规模化的生产，满足人们日益增长的需求。

植物生物技术与组织培养技术繁殖濒危植物不受季节和环境条件等因素的影响，是解决上述难题的重要途径。本发明要解决的首要问题就是找到羊踯躅组织培养过程中外植体有效的灭菌方法及其生长繁殖的最适宜培养基组分以及不定芽生根、驯化移栽条件的控制等关键技术问题，进而建立起羊踯躅的快速繁殖体系，最终实现羊踯躅在短时间内大量、快速、高质量的繁殖。这可以有效地满足人们对羊踯躅日益增长的需求，进而减少人们对野生羊踯躅的破坏，有利于濒危野生羊踯躅的保护，具有巨大的科研价值、经济价值和生态价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种濒危羊踯躅离体组织培养繁殖与保存的方法，针对羊踯躅野外分布的地区和种群数量急剧减少，细小的种子在自然条件下发芽困难，而且对其人工扦插或分株繁殖也很难成活，组织培养过程中存在外植体灭菌困难，无菌外植体的获得率低，外植体分化和增殖困难等问题的不足，本发明提供一种濒危羊踯躅离体规模化繁殖与保存的方法，为实现羊踯躅在短时间内大量、快速、高质量的繁殖提供技术支撑，为满足人们对羊踯躅日益增长的需求提供组培苗，为保护野生濒危羊踯躅提供技术支持和参考。

本发明通过以下技术方案来实现的：

(1)外植体的活体增殖与选择：为了能收集更多分生能力好的腋芽，将野外活体羊踯躅的顶芽剪去，10-20天后每一枝条可新萌发3-5个新的嫩腋芽，等腋芽长至1-2cm时，从腋芽基部剪取腋芽，经自来水冲洗干净，滤纸吸干水滴后装入无菌容器备用；

(2)多重表面灭菌流程：外植体用软毛笔刷洗枝叶，用自来水洗去枝叶上的灰尘后，在超净台上放入无菌瓶中，用70％体积比的乙醇表面灭菌0.5-1分钟，接着多重灭菌法灭菌，即先用10％的双氧水H₂O₂表面灭菌10min，所述双氧水含0.5％的吐温20，无菌水冲洗2-3次，接着再用0.1％的升汞HgC1₂，所述升汞含0.5％的吐温20，灭菌5-8min，最后用无菌水冲洗3-5次，灭菌后的腋芽外植体备用；