[发明专利]一种濒危羊踯躅离体组织培养繁殖与保存的方法

权利要求书

1.一种濒危羊踯躅离体组织培养繁殖与保存的方法，包括以下步骤：

外植体的活体增殖与选择；

多重表面灭菌流程；

接种初代培养：取出外植体接种在腋芽启动分化的培养基上；

分化培养：将步骤3中的腋芽长至4-6cm时，去除老叶，取新长出的外植体顶芽和茎段1-2cm转接到分化扩繁培养基上6,7-V+ZT1.5mg/L+NAA0.05mg/L+2,4-D 0.05mg/L 进行脱分化和增殖培养20-40d，脱分化率达100％；

离体快速繁殖培养：将步骤4中经脱分化的不定芽转至繁殖培养基上；

羊踯躅不定芽的离体保存培养；

生根培养及驯化移栽；

其特征在于，

步骤（1）具体为：为了能收集更多分生能力好的腋芽，将野外活体羊踯躅的顶芽剪去，10-20天后每一枝条可新萌发3-5个新的嫩腋芽，等腋芽长至1-2cm时，从腋芽基部剪取腋芽，经自来水冲洗干净，滤纸吸干水滴后装入无菌容器备用；

步骤（2）具体为：外植体用软毛笔刷洗枝叶，用自来水洗去枝叶上的灰尘后，在超净台上放入无菌瓶中，用70％体积比的乙醇表面灭菌0.5-1分钟，接着多重灭菌法灭菌，即先用10％的双氧水H₂O₂表面灭菌10min，所述双氧水含0.5％的吐温20，无菌水冲洗2-3次，接着再用0.1％的升汞HgC1₂，所述升汞含0.5％的吐温20，灭菌5-8min，最后用无菌水冲洗3-5次，灭菌后的腋芽外植体备用；

步骤（3）：培养基组成为改良的6,7-V+ZT玉米素1.0mg/L，培养基的蔗糖用量30g/L，琼脂为0.8％，pH值为5.6，培养参数为25±2℃，相对湿度为60-70％，光照强度为2000-2500Lx，光照时间14h/d，技术指标为外植体污染率低于10％-20％；

步骤（4）培养条件同步骤3；

步骤（5）培养成分和培养条件同步骤3,每瓶40-50ml培养基中接种3-4个1-2cm的不定芽，从组培苗茎基部分化产生出丛生苗，技术参数为不定芽增殖系数达8-10.5；

步骤(6)：离体培养的不定芽可以在离体条件下延缓生长，采用的培养基为1/2的6,7-V+玉米素ZT1.0mg/L，培养基的蔗糖用量15g/L，培养温度15-20℃，其他培养的环境条件同步骤(3)；技术参数为不定芽3-4个月转接一次；

步骤(7)：切取步骤5中健壮、整齐一致的芽用于生根，生根培养基由1/2 的6,7-V基本培养基添加0.05mg/L NAA构成，培养条件同步骤3，30-40d后揭去已生根苗的瓶盖使组培苗适应自然环境2-5d，随后移栽入营养钵中，基质为珍珠岩：营养土＝1：2，进行驯化移栽，营养钵用小拱棚保湿，相对湿度为70-80％，温度为20-25℃，10-15d后逐渐揭开棚膜，15d后完全揭开小拱棚膜，技术参数为生根率和驯化成活率均85％以上。