[发明专利]靶向的RNA编辑

说明书

使用寡核苷酸构建体实现RNA编辑，所述寡核苷酸构建体包含(i)对于待编辑的靶核酸序列特异性的靶向部分和(ii)能够结合和募集天然存在于细胞中的核酸编辑实体的募集部分。核酸编辑实体比如ADAR通过靶向部分被重定向到预先选择的靶位点，从而促进与靶向部分相对应的靶RNA区域中的预先选择的核苷酸残基的编辑。

本申请要求英国专利申请1422511.4、1512467.0、1512595.8和1521987.6(分别于2014年12月17日、2015年7月16日、2015年7月17日和2015年12月14日提交)，其每个的全部内容并入本文作为参考用于所有目的。

技术领域

本发明在RNA编辑领域中，由此对靶RNA序列的核苷酸序列进行修饰例如以纠正突变。

背景技术

RNA编辑是一种天然的过程，通过这个过程，真核细胞通常以位点特异性和精确的方式改变RNA分子的序列，从而将基因组编码的RNA的全部数量(repertoire)增加数个数量级。已经描述了用于整个动物和植物界的真核物种的RNA编辑的酶，并且这些过程在从最简单的生命形式比如秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)到人类的后生动物中管理细胞稳态方面起重要作用。RNA编辑的实例是分别通过称为腺苷脱氨酶和胞苷脱氨酶的酶的腺苷至肌苷以及胞苷至尿苷转变。最广泛研究的RNA编辑体系是腺苷脱氨酶。腺苷脱氨酶是包含识别结构域和催化结构域的多结构域蛋白。识别结构域识别特定的dsRNA序列和/或构象，而催化结构域通过核碱基(nucleobase)的脱氨基作用在靶RNA附近或多或少预定的位置将腺苷转变为肌苷。通过细胞的翻译装置将肌苷读作鸟嘌呤，这意味着如果编辑的腺苷在mRNA或mRNA前体的编码区中，则可以重新编码蛋白质序列。A至I转变也可以发生在靶mRNA的5’非编码序列中，在原始起始位点上游产生新的翻译起始位点，这产生N-末端延长的蛋白质。此外，A至I转换可以发生在mRNA前体中的内含子或外显子的剪接元件中，从而改变剪接模式。作为这种RNA编辑的结果，可以包含或跳过外显子。腺苷脱氨酶是称为作用于RNA的腺苷脱氨酶(ADAR)的酶的广大家族的一部分，包括人类脱氨酶hADAR1、hADAR2和hADAR3。

使用寡核苷酸来编辑靶RNA在本领域是已知的，例如，参见Montiel-Gonzalez等人(Proceedings of the National Academy of Sciences2013，2013年11月5日，第110卷，第45期，第18285-18290页)。作者描述了使用基因工程化的融合蛋白靶向编辑靶RNA，该融合蛋白包含hADAR1蛋白的腺苷脱氨酶结构域，与噬菌体λ蛋白N的所谓B-box结合结构域融合。已将hADAR1的天然识别结构域去除以消除天然ADAR的底物识别性质，并由λN-蛋白的B-box识别结构域代替。B-box是由N-蛋白B-box结合结构域识别的17个核苷酸的短链RNA。作者构建了一种包含与用于编辑的靶序列互补的向导RNA部分的反义寡核苷酸，其通过N-结构域-脱氨酶融合蛋白融合至用于序列特异性识别的B-box部分。作者巧妙地表明，向导RNA寡核苷酸如实地将腺苷脱氨酶融合蛋白引导至靶位点，导致靶RNA的gRNA定向的位点特异性A至I编辑。

所提出的方法的缺点是需要由噬菌体λN-蛋白的B-box结合结构域基因地融合至截短的天然ADAR蛋白的腺苷脱氨酶结构域而组成的融合蛋白。这需要用融合蛋白转导靶细胞(这是主要障碍)，或者用编码工程化的腺苷脱氨酶融合蛋白的核酸构建体转染靶细胞，以在靶细胞中表达。当在多细胞生物体中实现编辑时，比如在针对人类疾病的治疗中，后者构成不小的障碍。