[发明专利]制备小脑祖先组织的方法

说明书

[技术领域]

本发明涉及用于在体外诱导人多能干细胞分化成小脑祖先组织的技术。

[背景技术]

小脑是运动系统的主要组成部分，是高度有序的脑结构，具有一些已确定的细胞类型。在包括人的羊膜动物中，小脑的早期发育是保守的。小脑发育的初始阶段是形成峡部形成体(isthmic organizer)，其位于中脑-后脑边界(midbrain-hindbrain boundary，MHB)。在其诱导影响下，在菱脑原节1(r1)的背侧区(翼板)中形成小脑原基(cerebellar anlage)(非专利文件1-3)。小脑细胞在r1中的两个不同的胚区(germinal zone)生成。一个是小脑板的脑室区(ventricular zone，VZ)，其表达碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)转录因子Ptf1a。Ptf1a⁺祖先细胞产生小脑皮质(浦肯野细胞(Purkinje cell)和中间神经元)和深部小脑核(DCN)的γ-氨基丁酸能神经元(GABAergic neuron)。另一个区是菱唇(rhombic lip，RL)，其表达另一种bHLH因子，即Atoh1(也称为Math1)。Atoh1⁺祖先细胞产生小脑谷氨酸能神经元，包括颗粒细胞(GC)、单极刷细胞(unipolar brush cell)和大DCN投射神经元(非专利文件4-9)。在这十年来在对小脑细胞分化的控制的理解方面已经取得了很多进展。这些知识已经促进了在体外由多能干细胞产生小脑神经元组成部分的技术进展(非专利文件10-13)。然而，所产生的细胞成分怎样组装形成错综复杂的小脑构造在很大程度上仍然保持是难以理解的。

本发明人之前报道通过重建三维(3D)培养过程中的自诱导信号传导微环境可以从小鼠胚胎干细胞(mESC)有效地生成小脑神经元(非专利文件11)。mESC具有响应Fgf2和胰岛素在聚集体内形成一些峡部形成体组织的潜力。在那些条件下，当用抑制剂抑制内源性Shh信号传导时，mESC-衍生的神经祖先细胞分化成表达浦肯野细胞祖先细胞标记Kirrel2(也称为Neph3)的小脑板NE。另一方面，向培养物中加入BMP信号促进向Atoh1⁺ GC和Tbr1⁺DCN神经元的分化，而其抑制浦肯野细胞在mESC聚集体中的产生。尽管在mESC中能够成功地诱导小脑神经元分化，但是目前尚未再现小脑原基的3D形成。

已经报道，Fgf19，即小鼠Fgf15(在MHB中表达)的人直向同源物，参与后脑背侧祖先细胞的发育(非专利文件14和15)。

SDF1(也称为CXCL12)，即分泌的针对趋化因子受体4(CXCR4)的配体，在脑膜细胞中表达并在表达CXCR4的外部颗粒(EGL)细胞的迁移中起关键作用(非专利文件16-19)。SDF1-或CXCR4-缺陷型小鼠异常发育，具有不规则的外部颗粒层(EGL)和异位存在的浦肯野细胞。

本发明人已经发现Rho相关卷曲螺旋激酶(Rho-associated coiled-coil kinase，ROCK)的抑制剂阻抑通过分散诱导的多能干细胞(特别是，人多能干细胞)的细胞死亡(专利文件1和2)。

[文件列表]

[专利文件]

专利文件1:JP-A-2008-99662

专利文件2:WO 2008/035110

[非专利文件]

非专利文件1:Wingate，R.J.T，和Hatten，M.E.(1999).The role of the rhombic lip in avian cerebellum development(菱唇在鸟类小脑发育中的作用).Development 126，4395-4404.

非专利文件2:Joyner，A.L.，Liu，A.，和Millet，S.(2000).Otx2，Gbx2and Fgf8interact to position and maintain a mid-hindbrain organizer(Otx2，Gbx2和Fgf8相互作用以安置并保持中-后脑组织体).Curr.Opin.Cell Biolo.12，736-741.