[发明专利]将干细胞分化为肝细胞谱系的方法

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求2014年10月8日提交的新加坡申请号10201406436U的优先权的权益，该新加坡申请的内容出于所有目的在此以引用方式整体并入。

技术领域

本发明大体上涉及生物技术领域。特别地，本发明涉及用于将定形内胚层的细胞分化为多个细胞谱系的方法。本发明进一步涉及用于进行如本文所述的方法的试剂盒和培养基。

背景技术

终末期肝衰竭导致严重的临床症状，包括出血、脑病和最终死亡。值得注意的是，肝主要含有肝细胞，所述肝细胞执行对活生物体至关重要的各种各样的功能。这些功能包括消除血流中有害的有毒副产物，如酪氨酸代谢物和氨，以及分泌血清蛋白质，包括白蛋白和凝血因子。

肝的发育和形态发生是一个复杂的过程。在早期胚胎发育期间，多能上胚层细胞在约E6.5形成前原条，其然后在约E7.5产生被称为内胚层胚层的细胞片。在E8.5，内胚层沿胚胎的前后轴延伸并闭合以形成肠管，最终产生沿着整个呼吸道和消化道的器官。在肠管形成期间，空间上不同的侧面和中间的内胚层祖细胞在中线会聚以形成后-前肠(PFG)和随后的肝芽(LB)，如通过小鼠胚胎中的命运作图研究所示。

已对肝的早期发育进行了仪器研究，然而，对包括肝的特化、肝细胞的形成和肝功能的成熟在内的过程的理解仍然有限。例如，对诱导肝干细胞的形成以及它们的成熟后代的机制仍不清楚。

此外，赋予肝细胞在体内植入、增殖和分化的能力的因素仍有待充分检查，其中仍然广泛经历获得成体样肝细胞的困难。

总之，尽管多能干细胞可产生具有一定肝功能的肝细胞，但是对于这些肝细胞进展为成体样状态仍然存在明显未克服的障碍。此外，从这些多能干细胞产生可在成体肝中植入并稳健地重新入驻住(repopulate)的“真正的”且可移植的肝细胞样细胞仍具有挑战性。

鉴于这些挑战，重要的是理解作为胚层的诱导和模式化以及分化为各种细胞谱系的多个步骤的基础的信号传导逻辑。特别地，重要的是理解调控肝特化的信号传导因子，并且使用基于人多能干细胞的分化构想出进行肝发生(hepatogenesis)的信号传导范式。

本发明的目的是阐明干细胞诱导和分化的基础信号传导逻辑，以便单向地驱使干细胞产生具有最少外源谱系的肝细胞。

发明内容

根据一个方面，提供了将定形内胚层(DE)谱系细胞分化为后前肠(PFG)谱系的方法，其包括使所述干细胞与：一种或多种视黄酸活化剂；和一种或多种TGFβ信号传导抑制剂接触。

根据另一方面，提供了将后前肠谱系细胞分化为肝芽(LB)祖细胞的方法，其包括使所述后前肠谱系的所述细胞与：一种或多种TGFβ信号传导活化剂、一种或多种Wnt信号传导调节剂；和一种或多种环AMP/PKA信号传导活化剂接触。

根据另一方面，提供了将肝芽祖细胞分化为肝祖细胞的方法，其包括使所述肝芽祖细胞与：一种或多种TGFβ信号传导抑制剂；一种或多种FGF信号传导抑制剂；和一种或多种Notch信号传导抑制剂接触。

根据另一方面，提供了将肝祖细胞分化为静脉周肝细胞的方法，其包括使所述肝祖细胞与：一种或多种Notch信号传导抑制剂、一种或多种糖皮质激素信号传导活化剂、一种或多种胰岛素信号传导活化剂；一种或多种抗坏血酸信号传导活化剂和一种或多种TGFβ信号传导活化剂接触。

根据另一方面，提供了将肝祖细胞分化为肝细胞样细胞的方法，其包括使所述肝祖细胞与：一种或多种环AMP/PKA信号传导活化剂、一种或多种糖皮质激素信号传导活化剂；一种或多种胰岛素信号传导活化剂；一种或多种抗坏血酸信号传导活化剂和一种或多种Notch信号传导抑制剂接触。

根据另一方面，提供了维持肝芽祖细胞处于自我更新状态的方法，其包括使所述肝芽祖细胞与一种或多种FGF信号传导活化剂和一种或多种Wnt信号传导活化剂接触。

根据另一方面，提供了维持肝细胞或肝细胞样细胞处于静脉周状态的方法，其包括使所述细胞与一种或多种Notch信号传导抑制剂和/或一种或多种Wnt信号传导活化剂接触。

根据另一方面，提供了维持肝细胞处于门静脉周状态的方法，其包括使所述细胞与一种或多种环AMP/PKA信号传导活化剂接触。

根据另一方面，提供了用于将定形内胚层(DE)谱系细胞分化为后前肠谱系的试剂盒，其包含一种或多种视黄酸活化剂和一种或多种TGFβ信号传导抑制剂。