[发明专利]细胞培养基及使用其的培养方法

说明书

本发明的课题在于提供一种不使用饲养细胞而能够提高细胞的增殖效率的细胞培养基，特别是提供一种不含有血清的细胞培养基。根据本发明，可以提供一种含有纤维蛋白5及Zeta多肽的细胞培养基。

技术领域

本发明涉及使用了纤维蛋白5及Zeta多肽的细胞培养基、细胞用培养基试剂盒、细胞培养系统、细胞的培养方法、以及iPS细胞增殖剂。

背景技术

通过近年来的研究，人ES细胞(hESC)或人iPS细胞(hiPSC)等人多能干细胞在再生医疗领域中实用化的可能性正在增高。这些多能干细胞具有能够无限增殖的能力和分化成神经细胞、心肌细胞、血液细胞或网膜细胞等各种细胞的能力，作为对疑难疾病、生活习惯病等的治疗方法而备受期待。

饲养细胞起到将用于维持培养多能干细胞、特别是人多能干细胞的生长因子供给于干细胞的作用。因此，一直以来，hESC、hiPSC等人多能干细胞的培养主要在源自小鼠的饲养细胞(MEF：小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast))层上进行。然而，在源自小鼠的饲养细胞共存下进行培养的方法会在人多能干细胞中混入饲养细胞，因此在对生物体的安全性上存在问题。

因此，作为不使MEF等饲养细胞混入人多能干细胞而进行培养的方法，已知有将MEF化学固定于培养基材而培养多能干细胞的方法(非专利文献1)。但是，上述培养方法仍存在未固定的细胞、剥离的细胞混入的可能性，并非完全防止饲养细胞的混入。而且，存在饲养细胞的品质不稳定的问题。

另一方面，作为能够维持培养人多能干细胞的活性，报告了各种人细胞类型(非专利文献2～5)。另外，还报告了不使用异种细胞而使用成纤维细胞、胎盘细胞、骨髓细胞、子宫内膜细胞等各种源自人的细胞作为饲养细胞的方法(非专利文献6)。但是，在源自人的饲养细胞的共存下进行多能干细胞培养的方法存在培养时制备该饲养细胞费事的问题、饲养细胞的品质不稳定的问题。

作为在饲养细胞不共存下培养多能干细胞的技术，已知有使用预先将培养基用MEF条件化培养基(MEF-CM)进行培养的方法。例如，专利文献1中记载了制备细胞条件化培养基(conditioned medium)的方法、及在MSC条件化培养基中存在14-3-3蛋白质zeta/delta(14-3-3protein zeta/delta)的情况，所述制备细胞条件化培养基的方法包括：在细胞培养用培养基中对间充质干细胞(MSC)、其后代或源自其的细胞系(cell line)进行培养的工序；以及对上述细胞培养基任选进行分离的工序，在所述细胞培养基中，以不一起培养的方式将胚胎干(ES)细胞集落或其后代接种于含有FGF的无血清培养基中，并使得到的细胞增殖，从而获得上述间充质干细胞(MSC)。然而，在使用了这些条件化培养基的培养方法中，存在必须制备条件化培养基的繁琐、饲养细胞的品质不稳定的问题，而且仅举出了14-3-3蛋白质zeta/delta作为MSC条件化培养基中所含有的蛋白质的一个例子。

另一方面，不需要利用各种细胞进行条件化的培养基、即化学成分确定的培养基的开发也在进行。例如，报告了通过添加玻璃体结合蛋白与IGF1的嵌合蛋白质(chimericprotein)而能够不使用饲养细胞培养ES细胞(非专利文献7)。另外，作为含有具有促进增殖效果的IGF的培养基，已有STEM CELL Technologies公司的mTeSR1(注册商标)、LifeTechnologies公司的STEMPRO(注册商标)等在市场销售。但是，对于多能干细胞的培养而言，仍存在无法稳定地培养、增殖性差这样的课题。另外，虽然对MEF的分泌物中的功能性蛋白质进行了分析(非专利文献8)，但尚未从条件化培养基中所含有的饲养细胞的分泌物中鉴定出有益的功能性蛋白质。