[发明专利]新颖的组织处理及成像方法

说明书

关于联邦赞助之研究或发展之声明

本发明是在国家科学基金会授予之补助编号：DBI-0953902下由政府支持进行。政府于本发明中具有特定权利。

与申请相关之交叉参考

本申请案主张于2014年7月3日提申之美国专利申请案14/324,019之优先权，所述申请案于此通过引用整体并入本文中。

发明背景

自动化组织学实验室仪器已以相对快速且一致的方式大幅改善病理实验室处理组织样品的能力，特别是活检样品。这些成果亦稍微降低对熟练组织学人员之依赖且提升诊断材料的品质。相似地，在其所有的限制下，目前载片扫描(slide-scanning)科技的发展已开始实现组织样品的远距观察及数位储存。但用于常规病理分析之传统石蜡(paraffin)包埋、切片机切割、苏木精-伊红(H&E)染色切片有些部分局限了使组织活检发展在速度、品质及完成度更为进步的能力。

组织样品的目测检查仍然为组织诊断分析的主流，但辅助研究的作用逐渐增加，例如取自遗传及蛋白质体学的数据。这种趋势依赖充足且适当保存之组织的可得性，其与较小样品及较快速的结果之利益竞争。此外，不完整的样品分析、制备的人为因素、非量化的解读、受限的成长模式资讯以及冗长的手动制备程序为人体样品之传统基于载片的组织学分析的一些部分，其限制了病理学的进展。这些与病理评估中惯例的初始诊断步骤特别地相关，初始诊断通常为核心活检或细针穿刺。

许多可选择的组织处理及成像方法已被提出并提到传统处理技术之限制。较近期的方法包含高解析度x射线电脑断层扫描(Zehbe等人，2010,J.R.Soc.Interface 7:49-59；Ritman,2011,Annu.Rev.Biomed.Eng.13:531-552)以及光学同调断层扫描(Zysk等人，2007,J.Biomed.Opt.12:051403-051403-21；Bizheva等人，2005,J.Biomed.Opt.10:11006-11006-07)。这些方法具有可使用于未经处理之新鲜组织且允许完整的3维目测检查而不改变组织及适于进一步特性化之优点。目前，尚未有适于常规病理学评估之能够产生足够解析度及对比度的影像之技术。

多光子显微镜(Multiphoton microscopy(MPM))，另一方面，具有提供极佳细胞细节之影像的能力，为用于研究样品分析之常用、有效的方法。短脉冲激光光的使用亦允许二次谐波产生(second-harmonic generation(SHG))的同步定位，使同时产生重复的不对称蛋白结构如胶原及类淀粉蛋白(amyloid)之可量化影像变成可能。不幸地，虽然使用于MPM之长波长可比共聚焦显微镜于更深的组织成像，但传统方法中以福马林固定之样本仅能在最多为50μm之深度才可达到清晰影像。先前尝试利用MPM透过固定组织成像，已使用连续切片(Ragan等人，2007,J.Biomed.Opt.12:014015-014015-9)或连续组织切除(Dechet等人，1999,J.Urol.162:1282-1284)，不是非常劳动密集就是在成像的过程中会导致组织样本的破坏，使它们在常规临床使用上无法发展。

外科手术的很大一部分涉及术中显微镜咨询，咨询主要用于判断手术是否需要额外切除或调整，根据肿瘤类型之特性或是否有在边缘之恶性肿瘤。错误的风险相当高─例如，重复手术、不必要的程序造成的永久身体伤害、甚至是死亡。然而，术中显微镜之现有标准方法有许多周知的限制，通常是以冷冻切片进行。其中主要为特定组织类型对冷冻的抗性以及与快速冷冻过程相关的型态变形，产生非常差的影像品质，在许多情况下完全排除它们的使用。

以上提到的点显示用于未切割且未包埋样品成像之新颖的组织处理方法是被需要的。组织清洗为有用的方法，其实际且显著地提高用于光学切片显微镜各种模式之成像的可用深度。过去在获得具有清晰度之深度高解析度影像的成果局限在小部分的应用。这些过去的方法未成功发展出可达到足以适当实施常规病理学及许多研究工作种类所需速度之处理方法。它们也尚未能够准确地重现在形态学评估经训练的专家习惯理解之色彩种类。

因此，可在相对短的时间内取得深度组织的高解析度影像之实用的新处理方法仍然被需要。此外，这些深度影像需要以让它们能够被病理学家及微解剖研究者可立即辨识之方式取得。本发明满足此未完成之需求。

发明内容