[发明专利]通过使抗体穿透细胞膜将具有完全免疫球蛋白形式的抗体定位在细胞质中的方法及其用途

说明书

技术领域

本发明涉及通过主动穿透细胞膜将完整免疫球蛋白形式的抗体定位在细胞质中的方法。

本发明还涉及诱导完整免疫球蛋白形式的抗体通过穿透细胞膜定位在细胞溶胶中的轻链可变区并涉及包含所述轻链可变区的抗体。

本发明还涉及与所述抗体融合且选自以下的生物活性分子：肽、蛋白、小分子药物、纳米粒和脂质体。

本发明还涉及用于预防、治疗或诊断癌症的组合物，其包含：所述抗体；或与所述抗体融合且选自以下的生物活性分子：肽、蛋白、小分子药物、纳米粒和脂质体。

本发明还涉及编码所述轻链可变区和所述抗体的多核苷酸。

本发明还涉及产生通过穿透细胞定位在细胞溶胶中的抗体的方法，所述方法包括以下步骤：用能够通过穿透细胞定位在细胞溶胶中的轻链可变区替换抗体的轻链可变区。

背景技术

完整免疫球蛋白形式的抗体具有高度稳定的Y形结构(分子量：150kDa)，其由两条重链(50kDa)蛋白和两条轻链(25kDa)蛋白组成。抗体轻链和重链分为可变区(其氨基酸序列在抗体间不同)和恒定区(其氨基酸序列在抗体间相同)。重链恒定区包括CH1、铰链、CH2和CH3结构域且轻链恒定区包含Cκ或Cλ结构域。

抗体重链和轻链可变区具有氨基酸序列在抗体间特别不同的部分且这些部分构成抗原结合位点且因此也称为“互补决定区(CDR)”。当检查抗体的三维结构时，这些CDR形成抗体表面的环。环以下存在结构上支持环的框架区。在重链和轻链中，分别存在三个环结构且这六个环结构彼此组合且与抗原直接接触。抗体的重链恒定区(Fc)通过其与FcRn(新生Fc受体)的结合保证在血液中的长半衰期且由于该特征，与小分子药物不同的是，抗体在机体中可为持久的。另外，抗体与FcγR(Fcγ受体)等的结合使其可能特异性地通过抗体依赖的细胞的细胞毒性和补体依赖的细胞的细胞毒性诱导过表达靶物质的细胞的死亡。近来出于治疗多种疾病的目的已开发的许多产品可通过多种人源化的方法展现改善的治疗效果，如使用人抗体FR(框架)的CDR移植方法从而克服免疫原性。

常规的抗体由于其大尺寸和亲水性而不能直接穿透活细胞。因此，最常规的抗体特异性靶向细胞外分泌蛋白或细胞膜蛋白(Kim SJ等人,2005)。一般的抗体和大分子生物药物具有的局限在于其不能穿过疏水细胞膜且因此不能结合且抑制多种疾病相关物质。一般而言，在用于与机制如细胞生长、特异性抑制等有关的研究的实验中使用的特异性地与细胞内物质结合的商业抗体不能直接用于处理活细胞且为使这些抗体结合细胞内物质，通过细胞膜渗透方法使用两亲糖苷皂苷的在细胞膜中形成孔的预处理过程是必须的。小分子物质、核酸或纳米粒等可通过使用多种试剂或方法如电穿孔或热激转运到活细胞中，但由于上述的大多试剂和实验条件负面影响蛋白或抗体的特征三维结构，蛋白或抗体可丧失其活性。已开发出特异性地与细胞内蛋白结合且抑制其活性的细胞内抗体(胞内抗体)，但这些抗体还不具有穿透活细胞的膜的能力且因此仅可应用于基因疗法且其在未来的应用性非常有限(Manikandan J等人,2007)。

与多种类型的抗体片段包括上述完整免疫球蛋白形式的抗体、大分子物质如重组蛋白等不同的是，小分子物质由于其小尺寸和疏水性质容易且有效地穿透活细胞。然而，为使小分子药物与多种细胞中的疾病相关物质特异性结合，需要靶物质的表面具有疏水口袋。具有该疏水口袋的靶物质仅形成细胞中总的疾病相关物质的约10％且由于该原因，小分子药物不能特异性地靶向大多细胞中的致病性蛋白(Imai K等人,2006)。

在多种疾病包括癌症中，存在在细胞中的蛋白-蛋白相互作用(PPI)中起重要作用的蛋白或与转录或信号相关的多种蛋白的突变和异常过表达。这样的蛋白中，通过其大和平的表面显示复杂的相互作用的与疾病特别相关的物质难以特异性地通过上述小分子药物抑制(Blundell等人,2006)。例如RAS，其为细胞质重要的肿瘤相关因子之一(目前尚不存在治疗剂)，作为通过细胞膜受体传输细胞外信号至细胞内信号系统的分子开关发挥作用。在约30％的人类癌症特别是结肠直肠癌和胰腺癌中，RAS在细胞中总是由于癌症相关突变活化且这样的致癌相关突变已知为赋予常规抗癌疗法强抗性的主要肿瘤相关因子(Scheffzek K等人,1997)。