[实用新型]一种检测鼠伤寒沙门氏菌的生物传感器

说明书

技术领域    

本实用新型涉及生物传感器技术领域，特别涉及基于核酸适配体检测鼠伤寒沙门氏菌的生物传感器。

背景技术   

沙门氏菌是肠杆菌科重要的食源性致病菌之一，在我国食物中毒病例中占有较高比率。鼠伤寒沙门氏菌因其耐药性强、传播途径广、侵染宿主多等特点，被广泛关注。研究表明鼠伤寒沙门氏菌具有极强的多重耐药性，对多数抗生素均表现出抵抗能力。调查中,鼠伤寒沙门氏菌感染数量占当年沙门氏菌感染总量的17%。同时,在我国境内已发现的 290 余种沙门氏菌血清型中, 鼠伤寒沙门氏菌也是最常见的血清型之一。

目前，主要用来检测鼠伤寒沙门氏菌的方法包括生化鉴定和血清分型。但此方法存在自身不可避免的缺点与限制，需经过增菌培养、选择筛选、生化鉴定、血清分型等流程,  耗时一周左右, 不利于快速、准确地对食品中的鼠伤寒沙门氏菌进行检测。因此, 有必要建立一种高效快速检测鼠伤寒沙门氏菌的新方法。

发明内容   

为了解决检测鼠伤寒沙门氏菌的方法中特异性和灵敏度都比较低、成本高的问题，本实用新型提供了一种特异性和灵敏度高、成本低、检测速度快的基于核酸适配体检测鼠伤寒沙门氏菌的生物传感器。使用本发明的生物传感器，沙门氏菌检测限可达1×10^-16mol/ml。

本实用新型还提供了基于核酸适配体检测鼠伤寒沙门氏菌的生物传感器的制备方法。

本实用新型中一共用到了4条DNA链，分别是：HAP、padlock probe、ligation probe、capture probe。

其序列分别为：

HAP：5’-TCT TGC CTA CGT CAT TTT TTT TAG TAA TGC CCG GTA GTT ATT CAA AGA TGA GTA GGA AAA GAT AGG CAA GA-3’（SEQ ID NO：1）；

padlock probe：5’-p-TGA CGT AGG CAA GAT AGA GGA GAC CCA GTA GCC AGA TGT AGC TTC GTA GGA CTT AAAGGT AGT TGG AGC TGT-3’（ SEQ ID NO：2）；

ligation probe：5’-TCT TGC CTA CGT CAA CAG CTC CAA CTA CC-3’（ SEQ ID NO：3）

capture probe：5’-GAG ACC CAG TAG CCA GAT GTA GCT-SH-3’（ SEQ ID NO：4）；

HAP中，中间下划线部分序列是适配体序列。

padlock probe：中间划线部分与capture probe序列相同。

其中发夹结构的序列HAP中，中间下划线部分序列为目标物鼠伤寒沙门氏菌的适配体，可以与目标物特异性的识别并紧密结合。由于变形而暴露出的5’端下划线部分为滚环复制的引物序列，可以与环中padlock probe中5’端下划线部分结合，起始滚环复制过程。

padlock probe 的5’端磷酸化，且下划线部分的序列和3’端部分的序列分别与ligation probe的5’端和3’端互补 ，在T4 DNA连接酶的作用下可以连接成环。

capture probe 的3’端修饰有巯基（-SH），可以与金电极形成稳定的Au-S键，从而将capture probe 固定在电极表面，5’端含有与padlock probe环状结构内部序列（加下划线部分）相同的序列，能够与滚环放大（Rolling Circle Amplification,RCA）的产物结合，从而起到捕获作用。

本实用新型中用到了两种酶：Phi 29 DNA聚合酶和T4 DNA连接酶。Phi 29 DNA聚合酶同时具有链延伸和置换功能，T4 DNA连接酶催化相邻 DNA 链的 5'-P 末端和 3'-OH 末端以磷酸二酯键结合的反应，需 ATP 作辅酶。

本实用新型中鼠伤寒沙门氏菌的检测是在均相溶液中实现的，通过滚环放大的方式来实现信号的放大，从而实现鼠伤寒沙门氏菌的高灵敏检测，并获得较低的检测下限。