[发明专利]免疫结合剂的溶解性优化

说明书

本申请是申请号为200980123815.6的分案申请。

相关申请

本申请要求于2008年6月25日提交的、名称为“SolubilityOptimizationofImmunobinders”的US61/075,692的优先权。

发明背景

已证明抗体在癌症、自身免疫疾病和其他病症的治疗中是非常有效和成功的治疗剂。尽管一般已在临床上使用全长抗体，但存在使用抗体片段可以提供的许多优点，例如增加组织穿透力、与增加其他效应子功能的能力结合的Fc效应子功能的不存在、和由较短的全身体内半衰期导致的较少全身性副作用的可能性。抗体片段的药代动力学性质表明，它们可能特别良好地适合于局部治疗方法。此外，抗体片段在特定表达系统中可以比全长抗体更容易产生。

一个类型的抗体片段是单链抗体(scFv)，其由经由接头序列缀合的轻链可变结构域(V_L)与重链可变结构域(V_H)组成。因此，scFv缺乏所有抗体恒定区结构域，并且先前的可变/恒定结构域界面的氨基酸残基(界面残基)变成溶剂暴露的。scFv可以通过已建立的重组改造技术由全长抗体(例如IgG分子)制备。然而，全长抗体转变成scFv通常导致蛋白质的弱稳定性和溶解性、低产量和高聚集趋势，这增加免疫原性危险。

因此，已尝试改善scFv的性质例如溶解性。例如，Nieba，L.等人(Prot.Eng.(1997)10：435-444)选择已知为界面残基的3个氨基酸残基且使其突变。他们观察到突变的scFv在细菌中周质表达增加，以及热诱导聚集速率减小，尽管热力学稳定性和溶解性未显著改变。此外，在他们的公开物中，他们明确地陈述，他们未观察到改造的scFv的天然蛋白质状态的任何溶解性的提高，如通过PEG沉淀法所测定的。其中对scFv内的特定氨基酸残基进行定点诱变的其他研究也已得到报告(参见例如，Tan，P.H.等人(1988)Biophys.J.75：1473-1482；Worn，A.和Pluckthun，A.(1998)Biochem.37：13120-13127；Worn，A.和Pluckthun，A.(1999)Biochem.38：8739-8750)。在这些各种研究中，选择用于诱变的氨基酸残基基于其在scFv结构内的已知位置(例如，来自分子建模研究)进行选择。

在另一种方法中，将来自表达极弱的scFv的互补决定区(CDR)移植到已证实具有有利性质的scFv的构架区内(Jung，S.和Pluckthun，A.(1997)Prot.Eng.10：959-966)。所得到的scFv显示改善的可溶性表达和热力学稳定性。

改造scFv以改善溶解性和其他功能性质中的进展在例如Worn，A.和Pluckthun，A.(2001)J.Mol.Biol.305：989-1010中综述。然而，仍需要允许合理设计免疫结合剂(immunobinder)，特别是具有优良溶解性的scFv的新方法。此外，仍需要改造scFv和其他类型的抗体从而赋予改善的溶解性--尤其是天然蛋白质的溶解性的方法。

发明概述

本发明提供了在可变重链区VH中包含溶解性增强基序的免疫结合剂以及改造免疫结合剂例如scFv抗体以赋予改善的溶解性的方法。在特定的实施方案中，本发明的方法包括用赋予改善的溶解性的优选氨基酸残基置换免疫结合剂的重链可变区和/或轻链可变区的序列内的对于溶解性潜在有问题的氨基酸。例如，在某些优选实施方案中，用亲水性残基置换疏水性残基。

优选地，提供的免疫结合剂，在本发明的改造方法中使用的或由本发明的改造方法产生的免疫结合剂是scFv，但其他免疫结合剂例如全长免疫球蛋白、Fab片段、单结构域抗体(例如Dab)和纳米抗体(Nanobody)也可以根据所述方法进行改造。本发明还包括根据改造方法制备的免疫结合剂，以及包含所述免疫结合剂和药学上可接受的载体的组合物。

在一个方面，本发明提供了免疫结合剂，所述免疫结合剂在重链氨基酸位置12、103和144(AHo编号)中包含下列溶解性增强基序之一：

(a)重链氨基酸位置12处的丝氨酸(S)；

(b)重链氨基酸位置103处的丝氨酸(S)；和

(c)重链氨基酸位置144处的苏氨酸(T)；或

(a1)重链氨基酸位置12处的丝氨酸(S)；

(b1)重链氨基酸位置103处的苏氨酸(T)；和

(c1)重链氨基酸位置144处的丝氨酸(S)；或