[发明专利]一种无损伤提取中华鲟DNA的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程领域，特别涉及一种无损伤提取中华鲟DNA的方法。

背景技术

中华鲟Acipensersinensis是一种古老的大型海河回游性鱼类，曾经分布于我国的长江和珠江河流，由于近年来过度捕捞、环境污染、水利工程建设等人为原因造成了中华鲟的数量急剧下降，现在珠江流域的中华鲟已经绝迹，中华鲟已成为极度濒危的物种。

然而，进行中华鲟的遗传多样性研究和保护需要大量的中华鲟样本进行生物分析，进行生物分析的基础往往是提取DNA和RNA进行研究。传统的提取中华鲟DNA的方法是从肌肉、鳍或者血液内提取，这些提取DNA的方法会对中华鲟造成很严重的损伤，影响中华鲟的后期育种工作，甚至会对幼小的中华鲟造成死亡，由此可见，开展一种无损伤提取中华鲟DNA的方法势在必行。

无损伤提取DNA是指在不伤害动物本身的情况下，通过收集脱落的毛发、皮肤、羽毛、粪便、尿液、脱落的鱼鳞等从中提取DNA的过程。目前关于鱼类无损伤提取DNA的报道仅有几篇，关于中华鲟无损伤提取DNA尚未报道。宋君等报道了一种鱼类DNA非损伤检测方法，宋君等用试剂盒对鲫鱼粘液提取DNA，结果证明了从鱼类粘液提取的DNA浓度和从尾鳍和鳞片提取的DNA浓度相差不大。

发明内容

本发明的目的是提供了一种操作简单快速的提取中华鲟DNA的方法，实现无损伤提取中华鲟DNA。

一种无损伤提取中华鲟DNA的方法，所述方法包括如下步骤：

1）获取样本：从中华鲟身上刮取粘液，置0-4℃中保存；

2）样本的处理：把所述步骤1）的粘液离心，除去上清液，得到离心后的粘液；

3）裂解细胞：把裂解液和蛋白酶K加入所述步骤2）离心后的粘液，50-60℃下水浴0.5-1.5h，得到裂解细胞后的粘液；

4）沉淀蛋白质：把饱和酚放入所述步骤2）裂解细胞后的粘液中，震荡20分钟，离心得到上清液，然后在上清液中加入氯仿，震荡18-25分钟，离心得到除去蛋白质的上清液；

饱和酚的作用是使蛋白质变性，抑制DNA酶的作用，氯仿的作用是除去饱和酚，氯仿可以和饱和酚混合，但是不会溶于水，DNA溶于水中，饱和酚溶于氯仿中，氯仿和水是分开的，使DNA中不含有饱和酚；

5）沉淀DNA：将-28℃至-20℃的异丙醇加入所述步骤3）除去蛋白质的上清液，剧烈震荡，离心除去上清液，得到沉淀为DNA；

异丙醇溶于水，但是不和DNA发生任何化学反应，并且可以夺取DNA中的水，使DNA脱水沉淀下来；

6）洗涤DNA：将70%的乙醇加入所述步骤5）沉淀中，离心除去上清液，洗涤沉淀物2-4次，得到洗涤后的DNA；

第五步的DNA沉淀会含有盐离子，70%乙醇的作用是除去盐离子；

7）获取DNA：加入超纯水至所述步骤6）洗涤后的DNA中，置于0-4℃下保存;完成中华鲟DNA的提取。

所述步骤1）从中华鲟身上刮取粘液的方向为顺着从中华鲟的头到尾的方向刮取，防止对中华鲟造成损伤。

所述步骤3）裂解液的配置为0.05MEDTA、5%SDS、0.01MTris-Hcl、0.3M乙酸钠，所述蛋白酶K浓度为20mg/ml。

所述步骤3）加入的裂解液和蛋白酶K的体积比为裂解液：蛋白酶K：离心后的粘液=40:2:15。

所述步骤3）把裂解液和蛋白酶K加入所述步骤2）离心后的粘液，56℃下水浴1h，56℃是蛋白酶K的最适温度，水浴1h溶解蛋白质和裂解细胞。

所述步骤2）、步骤4）、步骤5）和步骤6）中的离心条件均为温度0-4℃，转速为12000转/分钟，离心10-20分钟，低温离心的目的是防止在提取的过程中DNA降解。

本发明提供本发明的目的是提供了一种操作简单快速的提取中华鲟DNA的方法，有益效果如下：

1、本发明建立了一套完整的提取中华鲟粘液的方法，本发明可以快速有效的提取中华鲟DNA，提取的DNA条带清晰，无拖尾现象，说明提取的DNA质量高，不收蛋白质的污染，结果稳定可靠；

2、本发明提供的提取中华鲟粘液DNA方法不会对中华鲟造成任何损伤；

3、本发明提供的提取中华鲟粘液DNA方法根据粘液中的DNA易提取和易降解的特点，省去了苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）混合液和氯仿：异戊醇（24:1）混合液，比传统的酚-氯仿法更为简单快速，节省了DNA提取时间，从而有效防止DNA氧化造成的损失；

4、本发明提供的提取中华鲟粘液DNA方法费用比试剂盒法和酚氯仿法较低。