[发明专利]针对乳粉中α-乳白蛋白的高效分离和精确定量检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种分离、检测的技术领域，具体涉及一种利用高效凝胶液相色谱分离、检测乳粉中α-乳白蛋白的方法。

背景技术

母乳是婴儿成长最好的食物，但是，因各种原因不能母乳喂养或母乳供应不足情况下，婴儿配方乳粉成为可供选择的最佳食品之一。如今，婴儿配方乳粉的研制进程逐渐由宏观调整走向了微观调整，以使其更接近母乳。α-乳白蛋白是最近在国内外引起广泛关注的、母乳中存在而普通配方乳粉中含量较少的、对婴儿发育非常重要的乳蛋白质。

牛乳与母乳最显著的差别是其色氨酸和半胱氨酸浓度低，而α-乳白蛋白中含有丰富的赖氨酸和半胱氨酸，特别是色氨酸含量非常高，色氨酸和半胱氨酸除了都有助蛋白质结合的作用之外,对于不同生理,两者在氨基酸利用的重要途径中都是必不可少的组份。例如,色氨酸是神经传递介质5-羟色胺的前体,色氨酸状况可能会对有意识的行为和睡眠状况有影响。半胱氨酸是谷胱甘肽的组份,因此与保护机体组织防止过氧化损耗有关，半胱氨酸还是合成牛磺酸的前体。

用普通配方乳粉喂养的婴儿和用母乳喂养的婴儿相比，两者血浆中含有的氨基酸水平具有明显差距，前者特别是在色氨酸水平上表现很低。所以维持色氨酸和半胱氨酸的需要可以作为婴儿配方乳粉的一个重要指标，α-乳白蛋白的存在补足了其它蛋白质成分中相对缺少的色氨酸、赖氨酸和半胱氨酸。这些依据表明，需要在婴儿配方乳粉中加入α-乳白蛋白，使其接近母乳中α-乳白蛋白的含量比例。

婴儿配方乳粉一般都经过严格的杀菌处理，婴儿配方乳粉中的蛋白质在加热杀菌处理后会产生不同程度的三维空间变性，因此，能否将变性的和非变性的α-乳白蛋白提取出来，直接影响分析结果。

α-乳白蛋白的检测方法主要有聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、反相高效液相色谱（RP-HPLC）、离子交换液相色谱（FPLC）、高效毛细管电泳（HPCE），但存在着重现性差、对加工后乳制品的分离定量不理想、需要预先分离乳清蛋白与酪蛋白等问题。目前，国标中还没有规定乳粉中α-乳白蛋白的检测方法。由于没有相应的国家标准和行业标准，企业不能控制产品的质量，质量监督部门也不能对市场上产品进行监督，因此我们急需一种能准确可靠、方便快捷的检测乳粉中α-乳白蛋白的方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有高效液相色谱法检测乳粉中α-乳白蛋白含量分离不理想、定量不准确、不能检测变性的α-乳白蛋白的缺陷，提供一种利用高效凝胶液相色谱分离检测乳粉中α-乳白蛋白的方法。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案如下。

针对乳粉中α-乳白蛋白的高效分离和精确定量检测方法，该方法通过高效凝胶液相色谱法进行检测，针对乳粉特性设定所使用的处理试剂及试剂用量及处理参数，实现乳粉中α-乳白蛋白的高效分离和精确定量检测。

作为本发明的一种优选技术方案，该方法包括如下步骤：

A、α-乳白蛋白的提取：在下述三种方式中任选其一进行乳粉中α-乳白蛋白的提取：采用盐酸调节pH值提取、盐酸胍溶液和巯基乙醇提取、醋酸盐缓冲溶液提取；

B、高效凝胶液相色谱法检测：高效凝胶液相色谱的流动相采用下述两种溶液的任一种：pH=4.5-7.5的4-8mol/L的盐酸胍溶液、乙腈/水/三氟乙酸按体积比40-50/50-60/0.1配制的溶液；以流速0.4-0.8mL/min洗脱样品，柱温25-40℃；检测波长为210-280nm。

作为本发明的一种优选技术方案，步骤A中，在下述三种方式中任选其一进行乳粉中α-乳白蛋白的提取：采用盐酸调节pH=4.6提取、盐酸胍溶液和巯基乙醇提取、pH=4.6的醋酸盐缓冲溶液提取；

作为本发明的一种优选技术方案，步骤A中，α-乳白蛋白的提取采用盐酸胍溶液溶解样品再加入巯基乙醇进行处理，其中盐酸胍溶液浓度为5-7moL/L，巯基乙醇的量为每1.5mL盐酸胍溶液添加5-20μL。

作为本发明的一种优选技术方案，步骤B中所述的高效凝胶液相色谱柱采用TSK-GelG2000SWXL5μm、TSK-GelG3000SWXL5μm、TSK-GelG2000SW10μm凝胶柱中的任一种。

作为本发明的一种优选技术方案，步骤B中所述的流动相采用pH为5.5-7.5的5-7.5mol/L的盐酸胍溶液，以流速0.4-0.7mL/min洗脱样品，柱温25-35℃。

作为本发明的一种优选技术方案，步骤B中所述的流动相采用pH为6.0-7.5的6-7mol/L的盐酸胍溶液，以流速0.4-0.6mL/min洗脱样品，柱温25-30℃。