[发明专利]一种高纯度心肌细胞原代培养方法

说明书

技术领域

本发明提供了一种高纯度心肌细胞原代培养方法，适用于在细胞水平进行相关心血管疾病研究，从细胞分子水平阐明机制问题，属于生物技术及医学领域。

背景技术

随着心脏病发病率逐年升高，有关心肌疾病的研究越来越受到重视。乳鼠心肌细胞体外培养可保留机体原有的一些结构和功能上的特点，具有搏动性，并且不受神经、体液等因素的干扰，可进行心肌细胞生长发育，病理生理、以及药理等多方面的实验研究，因此乳鼠心肌细胞的原代培养在心血管疾病的防治研究领域中应用广泛。

然而由于乳鼠心肌细胞原代培养方法种类繁多，并且心肌细胞在原代培养过程中容易受到损伤，造成存活率低。并且，心脏约80％由心肌细胞组成，另外约20％主要由成纤维细胞等非心肌细胞组成，而心肌细胞不易贴壁，成纤维细胞能快速贴壁，因此，在心肌细胞的原代培养过程中，容易形成成纤维细胞生长优势，从而导致心肌细胞纯度不高等缺陷。如何获得大量具有正常生理功能的心肌细胞，提高细胞的纯度是心肌细胞培养中的关键问题。

心肌细胞原代培养主要有3种方法：离体心脏灌注法，组织块法和酶消化法。离体心脏灌注法对乳鼠来说，操作难度较大。组织块法操作简单，能获得较高纯度的心肌细胞。酶消化法对酶的浓度以及酶作用的时间有严格的控制，但是能获得大量的单细胞。因此，心肌细胞的原代培养，多用组织块法和酶消化法。两种方法各有优缺点。

1.组织块法：

优点：(1)操作简单，不需要酶消化，只需将心脏剪成小块，在培养皿均匀铺满即可。(2)分离得到的心肌细胞结构完整，没有酶的消化作用，所以，得到的心肌细胞存活率高，形态结构完整。(3)不需要繁琐的实验步骤，对试剂耗材要求较低，经济节约。

缺点：获得的心肌细胞数量少，难以满足实验所需。如果需要大量心肌细胞，则需要进行多次分批分离，所需实验周期长，难以达到实验目的。

2.酶消化法是指采用胰蛋白酶和Ⅱ-型胶原酶混合消化心脏组织块，从而分离得到单个的心肌细胞。

优点：酶对组织块的消化可以获得大量单个分离的心肌细胞，可以满足对心肌细胞数量要求较高的实验。

缺点：对细胞损伤较大，由于酶对心肌细胞的作用，以及离心，重悬等步骤，会对分离的心肌细胞有不同程度的化学或物理损伤。并且，酶的浓度以及酶作用时间不同，对心肌细胞的损伤程度也不同。心脏组织中的成纤维细胞由于贴壁能力强，并且心肌细胞在酶液的消化作用下有不同程度的损伤，所以很容易形成成纤维细胞的生长优势，从而逐渐稀释心肌细胞，导致分离得到的心肌细胞纯度很低。

两种方法各有利弊，因此，想要在短时间内获得大量存活率高且纯度高的心肌细胞以满足实验要求是一个技术难题。

发明内容

本发明解决了现有技术中的不足，提供了一种能够快速分离得到大量纯度高、活力好的心肌细胞的原代培养方法。

实现本发明上述目的所采用的技术方案为：

一种高纯度心肌细胞原代培养方法，包括以下步骤：

(1)、将离体的乳鼠心脏转入盛有DMEM/F12基础培养基的培养皿中，将心脏剪成组织碎片；

(2)、将组织碎片转入EP管中，加入酶消化液，所述的酶消化液由Ⅱ-型胶原酶、胰蛋白酶以及PBS缓冲液组成，酶消化液中Ⅱ-型胶原酶的质量百分比浓度为0.04％，胰蛋白酶的质量百分比浓度为0.09％；

(3)、将EP管置于35～40℃水浴条件中进行第一次消化，消化时间为6～10分钟，消化完毕后吸取上清液后并弃去；

(4)、将EP管继续置于35～40℃水浴条件中，继续加入酶消化液进行后续消化，消化时间为10～12分钟，消化完毕后吸取上清液后并将上清液放置于离心管中，所述离心管中预先放置了含有胎牛血清的DMEM/F12完全培养基，离心管置于冰上；

(5)、重复步骤(4)，循环提取上清液，直至EP管中的组织碎片变白并变小后，完成上清液的收集，离心管中所收集的上清液即为心肌细胞悬液；

(6)、将收集好的心肌细胞悬液离心并除去上清，再加入DMEM/F12完全培养基，进行心肌细胞重悬，制得心肌细胞重悬液；

(7)、然后将心肌细胞接种在培养皿A中进行差时贴壁1～1.5h；

(8)、吸取培养皿A中的心肌细胞悬液到培养皿B中，清洗培养皿A中沉于皿底但未贴壁的心肌细胞并重悬，然后转入到培养皿B中进行培养。

步骤(3)中在第一次消化时摇晃EP管，并取出EP管弹2-10次，弹完后立刻水浴加热。